響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶提取土茯苓多糖工藝※

鄭朝陽　肖蘭華　覃　軍

土茯苓（Rhizoma Smilacis Glabrae） 為百合科植物光葉菝葜的干燥根莖。其味甘、淡，性平，有解毒，除濕，通利關(guān)節(jié)的功效，主要用于治療濕熱淋濁，帶下，瘰疬，疥蘚，梅毒及汞中毒引起的肢體拘攣，筋骨疼痛[1-2]。土茯苓多糖為土茯苓重要活性成分之一，其藥理作用廣泛，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等生物活性，有很好的藥用價(jià)值。目前，對(duì)土茯苓多糖的提取方法主要有熱水煎煮，堿浸提法，酶提取法等。酶法提取條件溫和，簡(jiǎn)單，可以更快速地得到活性不被破壞的粗多糖，且加入的反應(yīng)試劑較少，減少環(huán)境污染。因此，近年來，酶提取法受到了廣泛的關(guān)注。但目前對(duì)中藥多糖的提取多用纖維素酶，對(duì)其他酶的研究較少，為更高效的提取多糖，本次實(shí)驗(yàn)將通過比較不同酶類提取的土茯苓多糖得率，篩選最佳酶，利用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳酶提取土茯苓多糖，單因素實(shí)驗(yàn)研究酶解時(shí)間、酶解pH、酶用量這三個(gè)因素對(duì)土茯苓多糖得率的影響，為建立更高效的土茯苓多糖提取工藝和后續(xù)的發(fā)展提供可靠的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；BT125D型十萬分之一電子天平和BS224S型萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；U-2910型紫外雙光束分光光度計(jì)（日本日立公司）；恒溫水浴鍋（上海精宏公司）；B600A型低速離心機(jī)（白洋公司）。

1.2藥材及試劑 土茯苓藥材飲片（康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：170349316）；植物精提002酶、纖維素酶（寧夏夏盛實(shí)業(yè)基團(tuán)有限公司）；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司）；濃硫酸、苯酚、冰乙酸、D(+)Glucose等均為分析純，水為蒸餾水。

2　研究方法

2.1多糖提取方法 將土茯苓用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，稱取1.0 g土茯苓粉末于50 mL錐形瓶中，酶用量0.5%，50℃水浴酶解2 h，料液比1∶35，pH為5條件下提取土茯苓多糖。酶解結(jié)束沸水滅酶5 min，離心10 min（r=4000 r/min），去除可沉淀的雜質(zhì)，取上清液。

2.2土茯苓多糖含量的測(cè)定

2.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定100 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并定容至100 mL，制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于100 mL容量瓶中，加水定容，配制成濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL的葡萄糖溶液。各精密吸取2 mL于10 mL試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混勻，再立即加5 mL濃硫酸。放置冷卻，以相應(yīng)試劑為空白，于490 nm處測(cè)量。以吸光度值（A） 為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量（C）為橫坐標(biāo)，求其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2土茯苓多糖含量的測(cè)定取2.1中上清液適量置100 mL容量瓶中，加水定容。將其稀釋至合適濃度，于490 nm處測(cè)吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多糖得率。

式中C為由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的濃度，D為稀釋度，0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡聚糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)，M為土茯苓原料質(zhì)量。

2.3單一酶解法提取土茯苓多糖的試驗(yàn) 稱取土茯苓粉末6份每份1 g，置于50 mL錐形瓶，其中5份樣品分別加入不同種類的酶。其他條件相同，按2.1項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，比較多糖得率。

2.4土茯苓多糖提取工藝的優(yōu)化

2.4.1單因素試驗(yàn) 在2.3的基礎(chǔ)上，選取提取土茯苓多糖最高的酶進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察酶解時(shí)間，酶解pH，酶用量對(duì)土茯苓多糖提取率的影響。

2.4.2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以酶解時(shí)間、酶解pH、酶用量為自變量，多糖得率為響應(yīng)值指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，并用其進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以確定土茯苓多糖的最佳提取條件，因素編碼表見表1。

表1　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平的編碼

2.5結(jié)果與分析

2.5.1苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，按照2.2.1所述方法實(shí)驗(yàn)。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A=8.84c-0.013，R2=0.9991，表明吸光度在葡萄糖濃度為0.01~0.05mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2五種酶的比較 由圖2可知，同等提取條件下，加酶可以顯著提高土茯苓多糖得率，纖維素酶，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶三者的多糖提取率都較高，其中木瓜蛋白酶的提取效果最好。最終選用木瓜蛋白酶為本次實(shí)驗(yàn)用酶。

圖2　酶種類的影響

2.5.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.5.3.1酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 精確稱量5份土茯苓粉末各1 g，置于50mL錐形瓶。提取時(shí)間分別為60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，水浴溫度50℃，酶用量0.5%，料液比為1∶35。酶解結(jié)束后，加水稀釋至100 mL，離心10 min（r=4000 r/min），取上清液1 mL加入100 mL容量瓶，定容。精密移取各樣品溶液2 mL，苯酚-硫酸法于490 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，結(jié)果見圖3。

圖3　酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率上升。但當(dāng)酶解時(shí)間超過150 min后，多糖提取率下降，這可能是由于酶解時(shí)間過長(zhǎng)從而導(dǎo)致了多糖結(jié)構(gòu)的改變或者是糖苷鍵的裂解，因此選擇最佳酶解時(shí)間為150 min。

2.5.3.2酶解pH對(duì)多糖提取率的影響 精確稱量6份土茯苓粉末各1 g，置于50 mL錐形瓶。提取pH分別為4、5、6、7、8、9，水浴溫度50℃，酶用量0.5%，酶解時(shí)間為120 min，料液比為1∶35。酶解結(jié)束后，加水稀釋至100 mL，離心10 min（r=4000 r/min），取上清液1 mL加入100 mL容量瓶，定容。精密移取各樣品溶液2 mL，苯酚-硫酸法于490 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，結(jié)果見圖4。

圖4　酶解p H對(duì)多糖得率的影響

酶的活性和穩(wěn)定性均受pH的影響，pH過高或過低都會(huì)降低酶的活性，影響酶的穩(wěn)定性，降低酶的催化作用。從而影響土茯苓多糖的提取率。由圖4可知，本次實(shí)驗(yàn)最佳酶解pH為8。

2.5.3.3酶用量對(duì)多糖提取率的影響 精確稱量6份土茯苓粉末各1 g，置于50 mL錐形瓶。水浴溫度50℃，酶用量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，酶解時(shí)間為120 min，料液比為1∶35。酶解結(jié)束后，加水稀釋至100 mL，離心10 min（r=4000 r/min），取上清液1 mL加入100 mL容量瓶，定容。精密移取各樣品溶液2 mL，苯酚-硫酸法于490 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，結(jié)果見圖5。

圖5　酶用量對(duì)多糖得率的影響

由圖5可見，隨著酶用量的增加，多糖提取率增大，當(dāng)酶用量為0.5%時(shí)達(dá)到峰值，之后再增大酶用量，多糖提取率不再增加。這是因?yàn)楫?dāng)酶的用量上升到一定濃度之后達(dá)到飽和，此時(shí)沒有多余的底物再有機(jī)會(huì)與酶反應(yīng)。

2.5.3響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

2.5.3.1響應(yīng)面分析方案與結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取酶解時(shí)間、酶解pH、酶用量3個(gè)因素為自變量，以多糖得率為因變量，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)方案，共有15組實(shí)驗(yàn)，其中12組為析因?qū)嶒?yàn)，3組為中心實(shí)驗(yàn)以估計(jì)誤差。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，回歸分析結(jié)果如表3所示。一般模型項(xiàng)（Model）反應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型相符情況，失擬項(xiàng)反映了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況。由上表可以看出，響應(yīng)面模型高度顯著（P<0.0001），顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)的P值為0.4178（P>0.05），說明該模型的擬合度較好，可以采用該模型確定最佳酶法提取土茯苓多糖的最佳條件。同時(shí)，該模型的R2=0.9944表示多糖提取率有99.44%的影響的變化來自于所選變量。一次項(xiàng)B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2都對(duì)土茯苓多糖提取率影響顯著；二次項(xiàng)AC較為顯著。在選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)土茯苓多糖的影響大小次序?yàn)椋築-pH>C-酶解時(shí)間>A-酶用量。

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　多糖提取率為響應(yīng)值回歸模型方差分析表

2.5.3.2交互項(xiàng)對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面三維圖分析 圖6~8為響應(yīng)面分析等高線圖以及對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面圖，可以較為直觀地看出任意兩個(gè)交互項(xiàng)對(duì)土茯苓多糖提取率的影響規(guī)律。

圖6酶用量（A）和酶解pH（B）對(duì)土茯苓多糖提取率的影響

圖6顯示了酶用量和酶解pH對(duì)土茯苓多糖提取率的交互影響作用。在酶解時(shí)間150 min下，利用曲面圖和對(duì)應(yīng)的等高線形狀，可以看出隨著酶用量和酶解pH的增大，土茯苓的多糖提取率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。

圖7酶用量（A）和酶解時(shí)間（C）對(duì)土茯苓多糖提取率的影響

圖7顯示了酶用量和酶解時(shí)間對(duì)土茯苓多糖提取率的交互影響作用。在最酶解pH為8下，利用曲面圖和對(duì)應(yīng)的等高線形狀，可以看出隨著酶用量和酶解時(shí)間的增大，土茯苓的多糖提取率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。

圖8酶解pH（B）和酶解時(shí)間（C）對(duì)土茯苓多糖提取率的影響

圖8顯示了酶解pH和酶解時(shí)間對(duì)土茯苓多糖提取率的交互影響作用。在酶用量為0.5%下，利用曲面圖和對(duì)應(yīng)的等高線形狀，可以看出隨著酶解pH和酶解時(shí)間的增大，土茯苓的多糖提取率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。

2.53.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design Expert 8.0.6.1優(yōu)化后的回歸模型對(duì)酶法提取土茯苓多糖的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了對(duì)最佳方案為木瓜蛋白酶的酶用量為0.6%、酶解時(shí)間為pH為8.08、150.34 min，在此條件下，可獲得較為理想的多糖提取率。考慮到實(shí)際可行性操作，最終修正酶法提取土茯苓多糖的條件為：酶用量0.6%、酶解pH為8、酶解時(shí)間150 min。根據(jù)修正條件對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，樣品平行三份，得到多糖提取率為26.31%，與理論值25.71%相比，相對(duì)誤差為2.33%，與理論值相近，說明擬合效果較好。

3　討論

酶法提取多糖，可以在溫和的條件之下提取多糖，可以更快速地得到活性不被破壞的粗多糖。酶具有微量高效的特點(diǎn)，及少量的酶就可以達(dá)到良好的多糖提取效果，避免了化學(xué)試劑的浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)酶為木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶是一種含巰基肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，在土茯苓多糖提取過程中可以使土茯苓中的游離蛋白質(zhì)發(fā)生水解，并進(jìn)一步水解結(jié)合蛋白中的蛋白質(zhì)，減少它們與土茯苓多糖的結(jié)合力，有利于土茯苓多糖的溶出。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取土茯苓多糖工藝，通過F值得出三個(gè)因素對(duì)多糖提取率影響順序?yàn)椋簆H＞酶解時(shí)間＞酶用量。兩兩交互影響的結(jié)果來看，酶用量-酶解時(shí)間、pH-酶解時(shí)間交互項(xiàng)對(duì)多糖提取率的影響顯著。經(jīng)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得出木瓜蛋白酶提取土茯苓多糖的最佳工藝為酶用量0.6%，酶解pH為8，酶解時(shí)間150 min，酶解溫度為50℃，在此條件下得到的實(shí)際多糖提取率為26.31%，與預(yù)測(cè)值25.71%的相對(duì)誤差為2.33%，表明此設(shè)計(jì)法用于酶法提取土茯苓多糖的工藝優(yōu)化可行，為今后能更好的開發(fā)和利用土茯苓多糖，可以從以下兩個(gè)方面開展研究。（1）本實(shí)驗(yàn)未對(duì)不同比例的酶進(jìn)行考察，三種酶對(duì)提取土茯苓多糖得率都較高，假如三種酶以不同比例混合是不是可以更好的提取土茯苓多糖。（2）未對(duì)酶提取多糖的機(jī)理進(jìn)行研究，從酶篩選結(jié)果可以看出，纖維素酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶是提取土茯苓多糖得率較高的三種酶，是不是可以說明蛋白質(zhì)與土茯苓多糖的結(jié)合是主要影響多糖溶出的因素。

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