云南地區不明原因猝死心肌CD8+T細胞表達及心肌電鏡觀察

孫仲春，付　華，賈彭林，楊啟琨，瞿勇強，雷普平

不明原因猝死(sudden unexpected death,SUD)是指經法醫病理解剖、組織學檢驗及常規毒藥物檢驗后仍不能明確死亡原因的猝死。不明原因猝死是當前法醫學領域研究的熱點問題之一。統計發現有1%～5%的死亡通過法醫學系統尸體檢驗不能得出明確死亡原因[1]。在云南地區還存在著一類特殊的不明原因猝死類型，該猝死主要發生在云南一些偏遠山區、半山區，具有明顯的家族或家庭聚集性、空間聚集性和時間聚集性等特點，被學者稱為云南不明原因猝死(yunnan sudden unexplained death,YNSUD)[2]。YNSUD自1978年首次報道以來，先后有20多個縣的50多個鄉鎮報告了400余例猝死病例[3]，因其死因不明，無有效的治療和預防措施，已成為嚴重的社會問題和法醫學鑒定難點[4]。有學者通過常規的HE染色觀察認為，部分YNSUD就是暴發性心肌炎。然而，心肌炎性損傷較為輕微的YNSUD通過常規的HE染色觀察并不能明確認定為心肌炎[5]。為探明云南地區不明原因猝死與心肌炎之間的關系，本研究對YNSUD心肌、散發性SUD心肌進行免疫組織化學染色，檢驗CD8+T細胞在心肌的表達情況，同時對YNSUD病例的心肌組織進行掃描電鏡觀察，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料本研究樣本均來自昆明醫科大學司法鑒定中心2013年至2015年，經鑒定為不明原因猝死病例29例(其中包括5例為YNSUD、24例為散發性不明原因猝死)，所選案例均經過常規HE染色后，光學顯微鏡下檢查未達到診斷心肌炎標準，其他均未發現異常。正常心肌對照組9例。免疫組織化學檢驗所用抗體(mouse anti-CD8)、SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。2例死后20 h解剖提取的YNSUD病例心肌組織進行掃描電鏡觀察。

1.2方法免疫組織化學檢驗：心肌樣品取材→包埋組織→切片→貼片→脫蠟→水化→抗原修復→血清封閉→加一抗→加二抗→顯色劑→復染→脫水→封片→顯微鏡觀察。掃描電鏡觀察：心肌樣品取材→固定→脫水→干燥→粘樣→鍍膜→掃描電鏡觀察。

1.3結果判定標準本研究按許良中的判斷標準：先將染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。再將陽性細胞所占的百分比評分：陰性為0分，陽性細胞簇10%為1分，11～50%為2分，51～5%為3分，>75%為4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積>3分為免疫反應陽性[6]；通過光學顯微鏡進行判斷定性，每個高倍視野≥5個炎性細胞或淋巴細胞為心肌炎，<5個為炎性細胞或淋巴細胞浸潤[7]；掃描電鏡結果由兩位專家分別進行觀察判斷。

2　結果

2.1免疫組織化學結果29例不明原因猝死病例中有2例散發性不明原因猝死心肌CD8+T細胞表達呈陽性，8例有淋巴細胞及單核細胞浸潤但無CD8+T細胞表達(其中YNSUD 1例，散發性不明原因猝死7例)但未達到心肌炎診斷標準；9例正常心肌對照組均為陰性，見表1、圖1。

表1　29例不明原因猝死心肌情況　例

A:YNSUD心肌組織;B:散發SUD心肌組織;C:散發SUD心肌組織;D:散發SUD心肌組織呈炎性改變。圖1　心肌組織中CD8+T細胞表達情況(HE,×100)

2.2心肌電鏡掃描結果2例YNSUD者心肌超微電鏡觀察得到的心肌超微結構未發現細胞間質中血管、心肌細胞的病理性改變，見圖2。

A:心肌間質自溶性改變；B:心肌肌原纖維自溶性改變；C:心肌肌原纖維自溶橫切面；D:心肌肌原纖維自溶橫切面。圖2　心肌肌原纖維電鏡掃描圖

3　討論

心肌炎性損傷較為輕微的病變如何明確認定為心肌炎是目前猝死心臟病病理研究的一個難點。有學者通過對云南地區不明原因猝死尸體解剖及病理組織學光學顯微鏡檢查表明，48%病例具有局灶性心肌炎改變[8,10,13]，但對其他無明顯炎性細胞浸潤的不明原因猝死是否存在心肌炎性損傷尚無研究報道。研究發現CD8+T淋巴細胞是免疫反應的效應細胞[8]，可介導細胞毒性作用，CD8+T細胞在病毒性心肌炎小鼠心肌組織浸潤的炎性細胞中所占的百分率與心肌組織病理積分及心肌細胞凋亡率均呈顯著正相關，與心肌細胞炎性損傷密切相關，可作為心肌炎性損傷的一個重要檢測指標[9]。

本研究通過檢測CD8+T細胞在云南地區不明原因猝死者心肌組織中的表達，結果有2例散發性不明原因猝死心肌CD8+T細胞表達呈陽性，表明其存在心肌炎性損傷，雖不能診斷為心肌炎，但其心肌炎性損傷可能與其死亡原因相關。本研究中5例YNSUD均未發現CD8+T細胞表達陽性，提示YNSUD與心肌炎無明確相關性。8例淋巴細胞及單核細胞浸潤表明心肌存在炎性反應應答，而淋巴細胞是特異性免疫功能的重要組成部分，淋巴細胞在抗感染免疫中發揮重要作用[9]，本研究中8例不明原因猝死心肌存在不同程度的淋巴細胞及單核細胞浸潤，提示不明原因猝死可能存在輕微心肌炎性反應。本研究掃描電鏡觀察，心肌組織主要呈自溶性改變，未發現其他病理性改變，其原因主要可能與檢查沒有在死者死亡后及時提取和送檢有關。掃描電鏡觀察需要機體死亡后立即取材與送檢，結合本研究結果及法醫病理尸體檢驗時通常都要死后數小時才能進行，故掃描電鏡觀察結果可能受自溶性改變影響較大。

YNSUD發病迅猛、病情變化快、突然死亡、病死率高，多數學者認其應為心源性猝死[10]。本研究中云南地區不明原因猝死者心肌CD8+T細胞的表達，僅在散發性不明原因猝死者心肌組織中存在CD8+T細胞，提示CD8+T細胞可能與心肌損傷的發生、發展存在聯系，可能與猝死的機制有關[11]。但是，這尚不能解釋云南地區不明原因猝死的發生機制，尤其是YNSUD的發生還可能與心臟離子基因變異、局灶性心肌炎、不明原因毒物(小白菌)中毒等多種原因相關[12-19]，有待進一步深入研究。

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