鎂合金浸提液對腸上皮細胞Bcl-2及Caspase-3的影響

王戰(zhàn)會，孫高斌，孫宗斌，張兵兵，鄭秋霞，劉少朋

金屬材料如不銹鋼和鎳鈦合金常被用作外科吻合釘和外科縫合材料。然而，這些金屬在人體內(nèi)會釋放一些有毒元素，比如鎳離子對周圍組織有致癌作用[1]。因此，尋找不含有毒元素的金屬或合金就顯得非常必要。可降解鎂合金在胃腸吻合中用作外科吻合釘和外科縫合材料似乎比較合適[2]。Witte等[3]發(fā)現(xiàn)可降解鎂合金在體內(nèi)有很好的生物相容性，并且和宿主有溫和的炎癥反應(yīng)。然而，F(xiàn)eyerabend等[4]報道鎂合金對不同的細胞有不同的影響。因此，為了研究鎂合金是否可用作外科吻合釘和外科縫合材料，了解鎂合金對腸上皮細胞的影響就顯得非常重要。將不同的植入材料植入兔的脛骨，與常用的植入材料鎳鈦合金和聚乳酸相比，術(shù)后3個月和6個月，LAE442和MgCa0.8沒有導(dǎo)致輸出淋巴結(jié)的形態(tài)出現(xiàn)改變[5]。和細胞壞死不同，凋亡需要某些基因的表達，某些受體和信號通路的介導(dǎo)[6]。為探討不同濃度Mg-Ca合金浸提液對人結(jié)腸黏膜上皮NCM460細胞Bcl-2及Caspase-3表達的影響，報道如下。

1　材料與方法

1.1材料醫(yī)療級純度的鎂鈣合金由北京大學(xué)工學(xué)院提供，該合金主要由高純度的鎂和高純度的鈣構(gòu)成。鎂鈣合金材料被加工成直徑11.3 mm、厚2 mm的圓片狀，在SiC砂紙上磨平并拋光后，用無水乙醇超聲清洗，最后用環(huán)氧乙烷消毒后待用。根據(jù)ISO 10993 制備鎂鈣合金浸提液[7]。直徑11.3 mm、厚2 mm的鎂鈣合金圓片浸沒在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，使每1.25 cm×1.25 cm的鎂鈣合金表面積有1 mL的高糖DMEM培養(yǎng)液。浸泡有鎂鈣合金的高糖DMEM培養(yǎng)液在37 ℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中放置24 h，然后收集浸提液，并離心浸提液。浸提液用高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋成100%、50%和10%的鎂鈣合金浸提液。將其保存在4 ℃冰箱中，3 d內(nèi)進行相關(guān)實驗。

1.2mRNA的提取NCM460細胞在不同濃度的鎂鈣合金浸提液中分別培養(yǎng)1、3、5 d。用TRIzol試劑從NCM460細胞中提取總RNA。勻漿：在培養(yǎng)瓶中加入1 mL TRIzol試劑裂解細胞，勻漿后樣品30 ℃孵育5 min。每1 mL的TRIzol試劑勻漿樣品中加入0.2 mL氯仿。手動劇烈振蕩管體15 s后，30 ℃孵育3 min。4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min。取上層水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后30 ℃孵育10 min后，于4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。移去上清液，加入75%乙醇，振蕩后，4 ℃ 7 500 r·min-1離心5 min。分光光度計測定RNA濃度，A260/280比值位于1.8～2.0之間。提取的總RNA用雙蒸水洗滌并儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)利用Prime-Script?RT試劑盒行反轉(zhuǎn)錄。在PTC-200 Peltier Thermal Cycler PCR反應(yīng)儀上行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，400 ng總RNA，2 μL 5× PrimeScriptTM緩沖液，0.5 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligod T Primer(50 M)，0.5 μL Random 6 mers primer (100 μM)和RNase-free 雙蒸水共計10 μL，37 ℃孵育15 min，然后在85 ℃持續(xù)5 s反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)即停止。將得到的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液儲存在-20 ℃?zhèn)溆谩Ｒ镉纱筮BTakara生物有限公司設(shè)計與合成。在LightCycler儀器上利用SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒進行real-time定量PCR試驗。PCR反應(yīng)液由如下組分配置而成：10 μL 2×SYBR?Premix Ex Taq TM buffer，0.5 μL的10 M引物，2 μL cDNA 和7.2 μL滅菌蒸餾水共計20 μL。PCR擴增程序如下：第一個循環(huán)在95 ℃持續(xù)30 s進行預(yù)變性，接著40個PCR循環(huán)：95 ℃持續(xù)5 s，62 ℃持續(xù)20 s。隨后在95 ℃和65 ℃之間進行融解曲線分析，目的基因的引物序列見表1。

表1　Real-time RT-PCR目的基因的引物序列

1.4Westernblot實驗在六孔板上種植NCM460細胞培養(yǎng)到細胞基本融合。然后，NCM460細胞在不同濃度的鎂鈣合金浸提液中分別培養(yǎng)1、3或5 d。接著用冷PBS洗兩次。融解Western細胞裂解液[20 mM Tris pH7.5，150 mM NaCl，1% Triton X-100，2.5 mM sodium pyrophosphate，1 mM EDTA，1%Na3VO4，0.5 μg· mL-1leupeptin，1 mM 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)]，混勻在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM。按照六孔板每孔加入100 μL裂解液的比例加入裂解液。充分裂解后，14 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。蛋白定量：以50份BCA試劑A加1份BCA試劑B(50∶1，試劑A：試劑B)的比例混合以配置BCA工作液(WR)。分別吸25 μL 標準品到微孔板的對應(yīng)孔中(濃度為0～1 000 μg· mL-1)。分別吸取2.5 μL待測樣品至微孔板對應(yīng)孔中，并加入22.5 μL稀釋液。每孔加入200 μL的WR，震板30 s以徹底混合均勻。蓋好微孔板，37 ℃孵育30 min，冷卻至室溫。測量570 nm的各孔吸收值，測得的每個標準孔和待測樣品孔的吸收值分別減去空白孔平均光吸收值。以校正過的BSA標準蛋白562 nm 測量值對其濃度繪制標準曲線。使用標準曲線定量待測樣品蛋白濃度。按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL蛋白上樣緩沖液(5×)的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液。沸水浴5 min，以充分蛋白變性。冷卻到室溫后，SDS-PAGE加樣孔內(nèi)上樣電泳，然后轉(zhuǎn)移到0.45 μm厚的PVDF膜。在室溫用封閉液封閉1 h，在4 ℃用一抗[兔抗-Bcl-2，1 μL 300(Santa Cruz，美國)；兔抗-Caspase-3，1 μL 200(Santa Cruz，美國)；兔抗-GAPDH，1∶300 (Boster，武漢，中國)]孵育過夜，再用TBST沖洗3次，每次10 min，然后再用二抗(HRP標記的羊抗兔IgG)室溫孵育PVDF膜1 h。再行化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，最后將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

2　結(jié)果

2.1Bcl-2和Caspase-3基因表達NCM460細胞分別在100%、50%、10%浸提液和對照組處理1、3和5 d后用real-time PCR 檢測Bcl-2 and Caspase-3基因的表達。在不同濃度的浸提液處理NCM460細胞后，MMP9基因在細胞中的表達變化。在NCM460細胞分別經(jīng)100%、50%、10%浸提液處理1 d后，Bcl-2基因在10%或50%浸提液處理的細胞中的表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。處理3 d后，Bcl-2基因在50%或100%浸提液處理過的細胞中的表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。處理5 d后，Bcl-2基因在50%或100%浸提液處理過的細胞中的表達顯著低于對照組 (P<0.05)，見圖1。NCM460細胞分別在100%、50%、10%浸提液和對照組處理1 d后，Caspase-3基因在細胞中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。處理3 d后，Caspase-3基因在50%浸提液處理過的細胞中的表達顯著高于對照組(P<0.05)。而且，在處理5 d后，Caspase-3基因在100%、50%和10%浸提液處理過的細胞中的表達顯著高于對照組的表達 (P<0.05)，見圖2。

圖1　不同濃度Mg-Ca合金浸提液中NCM460細胞Bcl-2基因表達

圖2　不同濃度Mg-Ca合金浸提液中NCM460細胞Caspase-3基因表達

2.2Bcl-2和Caspase-3蛋白表達NCM460細胞在不同濃度浸提液處理1、3和5 d后用Western blotting 檢測Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達。處理5 d后，Bcl-2基因在50%或100%浸提液處理細胞中的表達顯著低于對照組的表達(P<0.05)，見圖3。而處理5 d后，Caspase-3在100%、50%和10%浸提液細胞中的表達顯著高于對照組的表達 (P<0.05)，見圖4。

A：Western blotting檢測;B：Bcl-2/GAPDH蛋白比值。1:對照；2：10%浸提液；3：50%浸提液；4：100%浸提液。圖3　不同濃度Mg-Ca合金浸提液中培養(yǎng)5 d NCM460細胞Bcl-2蛋白表達

A：Western blotting檢測；B：Caspase-3 /GAPDH蛋白比值。1:對照；2：10%浸提液；3：50%浸提液；4：100%浸提液。圖4　不同濃度Mg-Ca合金浸提液中培養(yǎng)5 d NCM460細胞Caspase-3蛋白表達

3　討論

Bcl-2是細胞凋亡的細胞內(nèi)的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)點[8]。Bcl-2的功能不是促進細胞增殖而是抑制細胞程序性死亡[9]。而Caspases是由能促進凋亡的至少14個成員構(gòu)成的大家族[10]。Caspase-3是大家族的成員之一，處于凋亡有序“瀑布式”級聯(lián)反應(yīng)的下游，是最重要也是最終的效應(yīng)執(zhí)行者。多數(shù)誘導(dǎo)凋亡因素依靠Caspase蛋白的級聯(lián)激活反應(yīng)來實現(xiàn)細胞凋亡，Caspase-3是細胞凋亡過程中的最關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，Caspase-3蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑是多數(shù)凋亡刺激因素導(dǎo)致細胞凋亡。通過評價Bcl-2和Caspase-3的表達，以更深入地了解可降解鎂合金對腸上皮細胞的影響。NCM460細胞系被廣泛應(yīng)用于體外實驗，評價腸道植入材料的生物相容性。

3.1鎂合金的降解產(chǎn)物對NCM460細胞Bcl-2表達的影響研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Mg-6Zn合金浸提液即可導(dǎo)致細胞凋亡，Bcl-2基因的表達也降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NCM460細胞經(jīng)100%、50%、10%浸提液和對照組處理5 d后，Bcl-2基因在50%或100%浸提液處理細胞的表達顯著低于對照組，與上述文獻結(jié)果相一致。導(dǎo)致Bcl-2在不同濃度浸提液處理的細胞中表達不一致的機制仍不清楚，可能與浸提液中的鈣離子濃度有關(guān)。胞內(nèi)Ca2+濃度超載可以導(dǎo)致線粒體損傷，釋放細胞色素C，活化Caspases，誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。Caspase-3與其他凋亡蛋白家族成員發(fā)揮作用，通過降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，使Caspase家族成員激活并被水解后形成級聯(lián)反應(yīng)，最后在核小體連接處切割DNA鏈接片段，使細胞凋亡[13]。

3.2鎂合金的降解產(chǎn)物對NCM460細胞Caspase-3表達的影響有研究發(fā)現(xiàn)，Mg-6Zn合金浸提液在一定范圍內(nèi)處于較高濃度時易誘導(dǎo)IEC-6細胞凋亡及Caspase-3的表達，且隨濃度升高影響增大[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NCM460細胞經(jīng)100%、50%、10%浸提液和對照組處理5 d后，Caspase-3基因在100%、50%和10%浸提液處理細胞中的表達顯著高于對照組的表達，與相關(guān)文獻結(jié)果相一致[15]。同樣，導(dǎo)致Caspase-3在不同濃度浸提液處理的細胞中的表達不一致的機制仍不清楚，可能與浸提液中的鎂離子及鈣離子濃度有關(guān)[16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，一些稀有元素對細胞凋亡也有影響[17-18]。同時，也有研究報道氟化物修飾的鎂合金對細胞凋亡沒有明顯影響[19]。許多研究認為，植入的鎂合金對植入物附近的細胞凋亡無明顯影響，這可能與植入物降解較慢，同時降解的離子會擴散到血液及遠處組織有關(guān)[11]。

總之，Mg-Ca合金浸提液在一定范圍內(nèi)處于較高濃度時易誘導(dǎo)NCM460細胞Caspase-3的表達，而抑制Bcl-2的表達，可能與鎂離子及鈣離子濃度有關(guān)。通過對Bcl-2和Caspase-3聯(lián)合活性測定，可以進一步了解Mg-Ca合金浸提液對細胞凋亡的影響，對進一步研究Mg-Ca合金的生物相容性提供有利幫助。

參考文獻：

[1]Denkhaus E,Salnikow K.Nickel essentiality,toxicity,and carcinogenicity[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2002,42(1):35-56.

[2]Hausmann U,Feussner H,Ahrens P,et al.Endoluminal endosurgery:rivet application in flexible endoscopy[J].Gastroint Endosc,2006,64(1):101-103.

[3]Witte F,Ulrich H,Rudert M,et al.Biodegradable magnesium scaffolds:Part 1:appropriate inflammatory response[J].J Biomed Mater Res A,2007,81(3):748-756.

[4]Feyerabend F,Fischer J,Holtz J,et al.Evaluation of short-term effects of rare earth and other elements used in magnesium alloys on primary cells and cell lines[J].Acta Biomater,2010,6(5):1834-1842.

[5]Bondarenko A,Hewicker-Trautwein M,Erdmann N,et al.Comparison of morphological changes in efferent lymph nodes after implantation of resorbable and non-resorbable implants in rabbits[J]. Biomed Eng Online,2011,10(1):32.

[6]Brodbeck WG,Shive MS,Colton E,et al.Influence of biomaterial surface chemistry on the apoptosis of adherent cells[J].J Biomed Mater Res,2001,55(4):661-668.

[7]Mani G,Feldman MD,Patel D,et al.Coronary stents:A materials perspective.Biomaterials[J].Biomaterials,2007,28(9):1689-1710.

[8]Feng L,Precht P,Balakir R,et al.Evidence of a direct role for Bcl-2 in the regulation of articular chondrocyte apoptosis under the conditions of serum withdrawal and retinoic acid treatment[J].J Cell Biochem,2015,71(2):302-309.

[9]Hong-Duck U.Bcl-2 family proteins as regulators of cancer cell invasion and metastasis:a review focusing on mitochondrial respiration and reactive oxygen species[J].Oncotarget,2016,7(5):5193.

[10]Julien O,Wells JA.Caspases and their substrates[J].Cell Death Differ,2017,24(8):1380-1389.

[11]Chen Y,Yan J,Wang X,et al.In vivo and in vitro evaluation of effects of Mg-6Zn alloy on apoptosis of common bile duct epithelial cell[J].Biometals,2014,27(6):1217-1230.

[12]Mathai JP,Germain M,Shore GC.BH3-only BIK regulates BAX,BAK-dependent release of Ca2+from endoplasmic reticulum stores and mitochondrial apoptosis during stress-induced cell death[J].J Biol Chem,2005,280(25):23829-23836.

[13]Fan TJ,Han LH,Cong RS,et al.Caspase family proteases and apoptosis[J].Acta Biochim Biophys Sin,2005,37(11):719-727.

[14]王嘯虎,陳義鋼,于嵩,等.不同濃度Mg-6Zn合金浸提液對腸上皮細胞凋亡及其相關(guān)基因Caspase-3表達的影響[J].材料導(dǎo)報,2015,29(8):47-51.

[15]Wang Z,Yan J,Li J,et al.Effects of biodegradable Mg-6Zn alloy extracts on apoptosis of intestinal epithelial cells[J].Mat Sci Eng B,2012,177 (4):388-393.

[16]郭莉莎,何永輝,王娟,等.生物可降解Mg-2Zn-0.2Mn合金的體外生物相容性[J].材料科學(xué)與工程學(xué)報,2013,31(5):703-707.

[17]Feyerabend F,Fischer J,Holtz J,et al.Evaluation of short-term effects of rare earth and other elements used in magnesium alloys on primary cells and cell lines[J].Acta Biomater,2010,6(5):1834-1842.

[18]Ding Y,Wen C,Hodgson P,et al.Effects of alloying elements on the corrosion behavior and biocompatibility of biodegradable magnesium alloys: a review[J].J Mater Chem B,2014,2(14):1912-1933.

[19]Lozano RM,Pérez-Maceda BT,Carboneras M,et al.Response of MC3T3-E1 osteoblasts, L929 fibroblasts,and J774 macrophages to fluoride surface-modified AZ31 magnesium alloy[J].J Biomed Mater Res A,2013,101(10):2753-2762.