皮膚黑色素瘤中神經母細胞瘤大鼠肉瘤基因突變分析

林 琳 倪 楠 趙海鷹 姜曉峰*

黑色素瘤作為皮膚腫瘤中侵襲性最高的惡性腫瘤之一，占皮膚惡性腫瘤的7%～20%[1]。研究表明，很多基因突變與黑色素瘤的發生、轉移的相關性越來越密切[2-3]。黑色素瘤惡性度高、侵襲能力強，而且對化療極不敏感，近年來，相關基因抑制劑在治療晚期黑色素瘤上，取得了顯著的療效[4]。由于黑色素瘤發生相關基因較多，發現更多有效的治療靶點成為研究的方向之一。

神經母細胞瘤大鼠肉瘤(neuroblastoma rat sarcoma，NRAS)基因全長85 kb，位于1號染色體，編碼含495個氨基酸的蛋白質[5]。研究顯示，在黑素瘤中，NRAS基因突變作為Ras家族中最常見的突變類型，突變率為20%[6-7]。NRAS是黑素瘤中第2個最常見的突變基因[8]。NRAS基因突變主要以Q6、G12、G13為主[9]。Uhara等[10]，通過對127例黑素瘤患者檢測，發現NRAS基因突變率7.1%且主要突變發生在Q61位點上，總比例為77.8%，對NRAS基因進行突變研究，對個體化的靶向治療有著重要的意義。本研究通過癌癥基因組圖譜集(the cancer genome atlas，TCGA)[11]公共數據，研究NRAS基因突變在黑色素瘤中的發生情況，為靶向治療提供有價值的線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取1978-2013年TCGA數據集中收集的黑色素瘤病471例，數據的使用符合TCGA的出版要求。按NRAS基因突變情況，將471例病例資料分為兩組，未突變組373例，年齡15～90歲，中位年齡59歲；突變組98例，年齡30～86歲，中位年齡56歲；性別、腫瘤位置、腫瘤分期、發病人種等臨床資料見表1。

1.2 統計學方法

應用cBioPortal和SPSS 17.0統計分析軟件，分析TCGA 數據集中NRAS基因突變情況，基因共表達、基因網絡調控及生存分析。生存分析采用Kaplan-Meier和log-rank檢驗法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 471例黑色素瘤患者臨床特征[例(%)]

2 結果

2.1 NRAS基因突變

在471個病例中，NRAS基因突變98例，占比20.80%(98/471)；在98例NRAS基因突變病例中，突變位點以Q61R為主，共41例，占41.84%(41/98)，Q61K突變31例，占31.63%(41/98)，Q61L突變10例，占10.20%(10/98)，Q61H突變4例，G12A突變1例，G12D突變1例，G12R突變2例，G13D突變1例，G13R突變2例，其他突變5例(見表2)。

表2 98例NRAS基因突變 [例(%)]

2.2 基因共表達分析

應用cBioPortal分析黑色素瘤TCGA數據集，進行基因共表達研究，結果顯示BCAS2、CSDE1、GNAT3、SIKE1基因mRNA與NRAS基因表達呈現一定程度的正相關(如圖1所示)。

圖1 NRAS 基因共表達分析示圖

2.3 生存期分析

應用cBioPortal分析黑色素瘤TCGA數據集，采用Kaplan-Meier Plotter在線數據進行生存分析，結果顯示，NRAS基因突變組與未突變組生存期無統計學差異，如圖2所示。

圖2 黑色素瘤患者生存期分析曲線圖

2.4 調控網絡分析

cBioPortal整合來自人類蛋白參考數據庫(human reference protein database，HPRD)、反應組學(Reactome)、國立癌癥研究所自然版(National Cancer Institute，NCI)-Nature和斯隆-凱特琳癌癥中心(The Memorial Sloan-Kettering Cancer Center(MSKCC) Cancer Cell Map)的數據，并對此進行分析，此調控網絡中包含51節點，包含NRAS基因和其50個相關基因，分析結果如圖3所示。

圖3 調控網絡分析示圖

3 討論

Ras基因家族包括NRAS基因、KRAS基因和HRAS基因，能調節細胞生長、增殖和分化。多項研究表明，NRAS基因突變與結直腸癌、黑色素瘤、急性髓細胞白血病等腫瘤的進程有著密切的聯系[11-13]。本研究結果顯示，在471個皮膚黑色素瘤病例中，NRAS基因突變表明，NRAS(R132)突變與黑色素瘤的發生、進展有較高程度的相關性。本研究還發現BCAS2、CSDE1、GNAT3、SIKE1等基因mRNA與NRAS基因表達呈現一定程度的正相關，其中CSDE1基因已有研究報道與黑色素瘤的侵襲、轉移相關[14]。BCAS2、GNAT3、SIKE1基因與黑色素瘤的相關性還需要進一步的研究。調控網絡分析結果顯示，調控網絡中共含51節點，包含NRAS基因和其50個相關基因，這些基因表明黑色素瘤的發生、發展與MAPK/ERK信號通路相關，此結果與Tonks等[15]研究報道一致。

目前，黑色素瘤的治療方法以手術切除為主，同時根據其他因素結合放療、化療、免疫治療等措施，而這些治療都具有相應的局限性，探索更多的治療方法尤為重要。有研究表明，針對一些基因突變的病例，如BRAFV600E、KIT基因突變，一些基因靶向的藥物已經進入臨床Ⅰ期、臨床Ⅱ2期實驗，并證實其有效性[16-17]。

這些研究為進一步探討NRAS基因突變與黑色素瘤的發生奠定了一定的基礎，并提示NRAS的Q61基因突變有可能成為黑色素瘤新的靶向治療位點，為靶向治療研究提供新的思路。

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