多藥耐藥基因相關產物P-gp和Topo-Ⅱ在結直腸癌中的表達及臨床意義*

廉 蕊 劉少卿 鄭紀寧 代俊利*

結直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是消化道疾病中常見惡性腫瘤之一，是由遺傳因素和環境因素的共同作用引起的，居常見惡性腫瘤的第4位，對人類的健康構成了嚴重的威脅。為提高患者的生存率，患者術后輔助化療是必要的輔助治療措施[1-2]。但是化療藥物治療時的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)是臨床化療常見的現象[3-5]。MDR是化療失敗的原因之一，MDR蛋白家族在化療失敗的所有機制中扮演著重要的角色[6]。本研究通過免疫組織化學檢測多藥耐藥基因相關產物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、拓樸異構酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ，Topo-Ⅱ)在CRC組織中的表達情況，分析多藥耐藥基因相關產物在CRC發生發展中的表達情況，研究P-gp和Topo-Ⅱ與腫瘤生物學行為的關系以及P-gp和Topo-Ⅱ兩者表達的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年2月至2016年2月經承德醫學院附屬醫院病理科確診為CRC的100例患者結直腸黏膜組織標本，其中高分化和中分化標本64例，低分化和未分化標本36例；另收集40例正常結直腸黏膜組織標本。所有CRC患者在術前均未行放射治療或者化療，患者的相關臨床及病理資料完整。

1.2 材料與試劑

兔抗人P-gp多克隆抗體(一抗，工作濃度1∶100)及兔抗人Topo-Ⅱ多克隆抗體(一抗，工作濃度1∶120)、免疫組織化學試劑盒(內含DAB顯色劑)皆購自北京中杉金橋生物技術公司。

表2 在100例CRC組織中P-gp和Topo-Ⅱ的表達及生物學行為的相關因素

1.3 免疫組織化學法

采用免疫組化鏈霉親和素-過氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)法[7]均按照免疫組織化學試劑盒說明操作，然后加一抗后4 ℃過夜，用已知的陽性CRC切片組織為陽性對照，將用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4 實驗結果判定

P-gp和Topo-Ⅱ皆主要定位于細胞漿或細胞膜上，以細胞漿內或細胞膜著黃色或棕黃色顆粒或團塊作為陽性染色的標準。評分采用綜合陽性細胞百分比率及染色強度評判。①染色強度：不著色記0分，淺棕黃色記1分，棕黃色記2分，深棕黃色或黃褐色記3分；②陽性細胞百分比率：＜10%記0分，10%～40%記1分，41%～70%記2分，＞70%記3分，最后將二者記分相乘為最后得分：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～5分為中陽性(++)，6～9分為強陽性(+++)，結果由兩位資深病理醫師雙盲讀片判定。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析所得數據，計數資料的比較采用x2檢驗，P-gp和Topo-Ⅱ的相關性檢驗采用Spearman等級相關檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P-gp和Topo-Ⅱ蛋白在CRC及正常結直腸黏膜組織中的表達

(1)P-gp和Topo-Ⅱ蛋白在CRC及正常結直腸黏膜組織中的表達主要定位于細胞漿或細胞膜上，如圖1所示。

(2)P-gp和Topo-IIⅡ蛋白在CRC中的陽性表達率分別為68.00%和74.00%，均明顯高于結直腸正常黏膜組織，其差異有統計學意義(x2=32.208，x2=25.901；P＜0.05)，見表1。

圖1 P-gp和Topo-Ⅱ蛋白在CRC中細胞漿或細胞膜上表達示圖(×200)

表1 P-gp和Topo Ⅱ在CRC和正常結直腸組織中的表達(%)

2.2 P-gp和Topo-Ⅱ蛋白的表達與CRC生物學行為的關系

CRC中P-gp和Topo-Ⅱ蛋白的表達與年齡、性別無關，其差異無統計學意義(x2=0.031，x2=0.018；P＞0.05)，與分化程度、Duke's分期、浸潤深度和有無淋巴結轉移有相關性，其差異有統計學意義(x2=7.981，x2=4.973，x2=17.961，x2=3.957；P＜0.05)，見表2。

2.3 P-gp和Topo-Ⅱ在CRC中表達的相關性分析

采用Spearman等級相關檢驗分析顯示，P-gp和Topo-Ⅱ在CRC中的表達呈正相關關系，差異有統計學意義(r=0.265，r=0.219；P＜0.05)。

3 討論

3.1 CRC與化療

CRC做為一個困難的問題，目前全球尚無解決方案。化療是CRC患者術后可用的方法之一。為了改善生存，輔助化療對患者一直被視為必要的消除微小轉移灶以及殘余的惡性腫瘤細胞，但是CRC因為MDR的存在，功效不佳，在所有耐藥機制中MDR蛋白家族扮演著重要的角色在所有耐藥機制中。MDR相關的蛋白質成為世界性難題，P-gp和Topo-Ⅱ是MRD家族中重要的兩種蛋白質，通過減少細胞內P-gp和Topo-Ⅱ的濃度可以降低細胞的耐藥性[8-13]。

3.2 P-gp和Topo-Ⅱ的表達

P-gp的最重要的作用是相當于一個外排泵的作用，屬于一種跨膜糖蛋白，可將細胞內的物質通過能量的給予排出細胞外。P-gp由1280個氨基酸組成，P-gp與進入細胞內的化療藥物結合，其過程為耗能過程，可將進入腫瘤細胞內的化療藥物泵至胞外[14]。P-gp的過度表達，使得腫瘤細胞內發揮作用的化療藥物的濃度下降，最后使得腫瘤細胞產生耐藥。在對與絲裂霉素(抗Topo-Ⅱ)有關的兩個細胞株(敏感株和耐藥株)的研究實驗中，觀察到耐藥株的Topo-Ⅱ表達下降，證明Topo-Ⅱ的表達很大可能與細胞的敏感性呈正相關性。本研究結果表明，P-gp和Topo-Ⅱ高于正常組織，結果有統計學意義，提示P-gp和Topo-Ⅱ在耐藥中發揮著重要作用。P-gp和Topo-Ⅱ與Duke's分期、浸潤深度、分化程度和淋巴結轉移有關，但與年齡和性別無關。在CRC中P-gp和Topo-Ⅱ與患者的性別及年齡差異，暫時且不認為二者在年齡與性別上存在差異。同時，表明在不同的Duke's分期、浸潤深度、分化程度和淋巴結轉移的狀況下P-gp和Topo-Ⅱ可表現為不同的表達狀態，對于臨床合理的為患者選擇適合的個體化的化療方案具有指導意義，可為化療方案的選擇提供理論依據。本研究結果表明，惡性程度越高，P-gp和Topo-Ⅱ的蛋白表達越高，且二者之間有相關性，但二者之間的相關關系有待進一步的深入研究，有望成為臨床化療藥物選擇的靶向切入點，為臨床CRC患者的治療帶來福音。

目前，臨床對CRC的治療，MDR是其面臨最嚴峻的問題。研究其耐藥產生的機制對于臨床治療有指導意義，對P-gp和Topo-Ⅱ等的深入研究，將有助于對CRC對化療藥物的耐藥的產生機制有更深入的研究，指導臨床醫務工作者為患者選擇最合適的個體化療方案。但由于其產生耐藥機制的不同，針對其選擇的逆轉耐藥的方式也不同。因此，探討P-gp和Topo-Ⅱ的表達及其之間的關系，為判斷患者的耐藥情況，提高患者的治療療效，延長患者的生存期以及指導臨床治療都能開闊更好的前景。

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