阿帕替尼對急性單核細胞SHI-1生長抑制作用及VEGF表達的影響

黃露迷 熊雙龍 王春梅 冀曉輝 王東林 李代蓉（通訊作者）

（重慶市腫瘤研究所/醫(yī)院/癌癥中心腫瘤內科 重慶 400030）

阿帕替尼為口服型VEGFR-2酪氨酸激酶抑制劑的一種，其在2014年在中國上市。這種藥物在治療晚期胃癌和胃食管交界癌中有著明顯效果[1]。其在延長諸如晚期肝癌、乳腺癌以及胃癌等類型疾病患者無進展生存期方面，有著滿意效果，但將其用于治療白血病方面，報道不多。結合實際情況，本文章全面分析阿帕替尼對急性單核細胞SHI-1生長抑制作用及VEGF表達的影響，現(xiàn)將具體結果報告如下。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

擇取SHI-1細胞株，來源于一例急性單核細胞白血病AMLM5b患者。樣本在-80℃環(huán)境下封存。實驗試劑為：RPMI1640基礎培養(yǎng)基、阿帕替尼（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司出品）。胎牛血清生產廠家為杭州四季青生物工程材料有限公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT），使用前，將其在PBS內制成5ml/Ml，后在4℃環(huán)境下保存，二甲基亞砜（DMSO）、VEGF ELISA試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 阿帕替尼對SHI-I細胞毒性情況

設立陰性對照、空白對照和實驗組三組，在空白組內加入100μL RPMI1640培養(yǎng)基；陰性組內接種SHI-1細胞；實驗組在陰性組基礎上，同時加入不同濃度的阿帕替尼。每種濃度設立三個復孔。

SHI-1細胞為對數(shù)期，密度2×105/mL，100μL。在孔板內孵育24、48h后取出。每孔內加入20μLMTT，后繼續(xù)孵育。4h后吸取上清液，每孔內加入DMSO，振蕩處理10min。將孔板放在酶標儀內，測定OD值，后計算細胞存活率以及半數(shù)抑制率。

1.2.2 SHI-1細胞VEGF表達量

選擇對數(shù)期細胞，開展離心，計數(shù)。將其加入到培養(yǎng)板內，細胞數(shù)為2×105/mL/孔。加入不同濃度阿帕替尼，繼續(xù)孵育，作用24h以及48h。收集培養(yǎng)上清，結合試劑盒方法，測定經作用后SHI-1細胞株培養(yǎng)上清VEGF表達量。

1.3 統(tǒng)計學原理

實驗數(shù)據均為3次重復實驗3次平行測定值的平均值，并采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，計量資料用（±s）表示，多個樣本均數(shù)之間比較采用方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD法，兩兩樣本均數(shù)之間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 阿帕替尼對SHI-1細胞毒性

阿帕替尼在5、10、20、40、80、160、320、640ng/mL的濃度范圍內，對SHI-1細胞株增殖有明顯的細胞生長抑制作用，作用24h與48h后，IC50分別為157.306±2.1ng/mL、92.509±1.9ng/mL。隨著阿帕替尼濃度及作用時間的增加，對SHI-1細胞的毒性作用更強，在320ng/mL時細胞的抑制率達75%。確定給藥濃度為5、20、40、80ng/mL，進行下述實驗。

2.2 阿帕替尼對SHI-1細胞VEGF分泌影響情況

SHI-1細胞過度表達VEGF，使用阿帕替尼處理24h以及48h后，當濃度為5ng/ml時，其和空白組的VEGF表達量無明顯差異。當為20ng/mL時VEGF量明顯比空白組高，給藥濃度和SHI-1細胞VEGF分泌呈現(xiàn)負相關，當給藥量為80ng/ml時，和空白組相比存在統(tǒng)計學意義，作用時間和VEGF表達量呈現(xiàn)反比。藥物濃度在40、80ng/mL時，24h組和48h存在差異，P＜0.05.詳見表。

表 不同濃度阿帕替尼作用下SHI-1細胞培養(yǎng)上清VEGF表達量（±s，n=9）

表 不同濃度阿帕替尼作用下SHI-1細胞培養(yǎng)上清VEGF表達量（±s，n=9）

不同濃度阿帕替尼（ng/mL） SHI-1細胞培24h 0 978.1±3 5 943.2±1養(yǎng)上清VEGF表達量（pg/mL）48h.1 981.3±3.3.8 938.3±1.7 20 504.3±1.7 460.9±1.6 40 348.8±1.5 232.7±1.7 80 237.2±2.5 143.5±2.7

3.討論

急性白血病為臨床常見病。其為經造血干細胞分化阻滯以及凋亡障礙以及不良增殖引起的單克隆特異性疾病。有文獻指出，阿帕替尼對HL-60細胞增殖有抑制作用，并可誘導HL-60細胞凋亡。對于FLT3-ITD陽性的AML患者，使用索拉菲尼治療能取得一定成效。體內體外報道指出，將靶向藥物應用在急性白血病治療中，前景廣闊[2]。

血管新生受到諸多因子調控，而VEGF為典型代表。癌細胞內可能存在VEGF的自我分泌機制，其通過和VEGFR-2結合，加強血管通透性，加速腫瘤細胞增殖。。阿帕替尼能夠競爭性的和VEGFR-2結合，繼而起到減少VEGF與其結合的機會，且能抑制VEGFR-2磷酸化，進而阻斷下游信號傳導。減少血管新生。當前諸多實驗證實，其在治療多種癌癥方面，具有一定效果[3]。

本實驗使用急性單核細胞白血病SHI-1細胞株為研究對象，并以MTT法對阿帕替尼對于SHI-1細胞株的毒性進行分析，結果證實，該藥物對于SHI-1細胞株有著一定殺傷性，且對于SHI-1細胞的抑制作用和濃度呈現(xiàn)正相關。當320ng/mL時細胞的抑制率達75%。同時測定阿帕替尼作用后SHI-1細胞株培養(yǎng)上清VEGF含量，比較有無阿帕替尼作用培養(yǎng)上清VEGF含量的變化，結果表明，無阿帕替尼作用培養(yǎng)上清中VEGF量明顯高于作用后，阿帕替尼能顯著降低白血病細胞VEGF的表達量。

[1]陳蘇寧,薛永權,吳亞芳,等.人單核細胞白血病細胞系SHI-1的多藥耐藥和耐藥蛋白的表達.江西醫(yī)藥,2007,10(33):1015-1017.

[2]朱興虎,夏學鳴,李建勇.急性單核細胞白血病的細胞生物學特性與療效的關系.臨床血液學雜志,2001,14(6):263-264.

[3]秦叔逵,李進.阿帕替尼治療胃癌的臨床應用專家共識[J].臨床腫瘤學雜志2015,09:841-847.