大鼠在體缺血后處理對肺細胞凋亡及肺Bax和Bcl-2表達的影響

陳瑩

（貴陽市第一人民醫院病理科 貴州 貴陽 550001）

缺血后處理是指組織或器官發生缺血后，在長時間再灌注之前進行數次短暫缺血/再灌注循環，從而減輕再灌注損傷的一種保護作用。肺缺血后處理的研究起步較晚，其保護機制還未確定。因此本實驗通過建立肺缺血/再灌注損傷模型，探討缺血后處理在肺I/R損傷中的保護作用及其可能機制。

1.材料和方法

1.1 實驗分組

成年SD大鼠60只，雌雄不拘，并隨機分為3組，每組20只。10%水合氯醛腹腔麻醉，氣管插管，接動物呼吸機。（1）sham組：開胸后游離左側肺門，不予其它處理；（2）I/R組：開胸后于肺充盈末用無創微血管夾夾閉左側肺門，45min后松開微血管夾，灌注180min；（3）IPO組：處理同I/R組，但在松開微血管夾即刻，采取復灌30s、停灌30s，連續6個循環，作為缺血后處理，之后再灌注180min。

1.2 標本的采集與處理

再灌注結束后，立即取出左肺，切取中段肺組織，置于福爾馬林中固定，以供HE染色、免疫組化及細胞凋亡檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 病理學觀察

常規石蠟包埋、切片，HE染色。

1.3.2 肺濕/干重之比

取出稱重的凍存肺組織，放置電熱恒溫鼓風干燥箱中，溫度80℃，連續烘烤24h至恒重后取出，用電子天平稱重，肺組織濕重／干重比值=（濕重-干重）／干重。

1.3.3 肺組織Bax、Bcl-2表達

采用鏈酶親和素一生物素一過氧化物酶（SABC）法，嚴格按試劑盒說明書操作結果判定：胞漿呈棕黃色顆粒狀的為陽性細胞。在400倍顯微鏡下隨機取5個視野，計數陽性細胞數及細胞總數，計算陽性細胞率。

1.3.4 細胞凋亡的檢測

嚴格按照試劑盒說明書進行。在400×顯微鏡下隨機取5個視野，計數陽性細胞數及細胞總數，計算凋亡指數。

1.4 統計學處理方法

所有數據用±表示，用SPSS統計學軟件作統計學分析，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為顯著性差異。

2.結果

2.1 病理學觀察

光鏡下可見sham組肺泡結構清晰，無水腫、出血。與I/R組相比IPO組的細胞損傷程度較I/R組明顯減輕。

2.2 肺組織濕重／干重比值

肺濕重／干重比值是反映肺組織水腫程度，特別是肺泡內水腫的常用指標。表l結果提示IPO能夠減輕肺I/R損傷所引起的肺水腫。

表1 各組肺組織濕重／干重比值的變化（±s）

表1 各組肺組織濕重／干重比值的變化（±s）

與Sham組比▲P＜0.05；與I/R組比△P＜0.05

組別 例數（n） 肺濕/干重比sham組 20 3.98±0.01△I/R組 20 8.33±0.64▲IPO組 20 4.32±0.46▲△

2.3 細胞凋亡指數

如表2所示與I/R組相比，IPO組肺組織細胞凋亡指數明顯減少。該項結果表明：I/R損傷可促進細胞凋亡的發生，而IPO則可顯著降低該項指標的陽性細胞數。

2.4 肺組織中Bcl-2和Bax表達的陽性細胞率：

從表2中可知，與I/R組比較，IPO組的Bcl-2表達顯著升高而Bax表達明顯降低。

表2 各組肺細胞凋亡指數以及Bax與Bcl-2陽性細胞率的比較

3.討論

IPO是指組織在長時間缺血后再灌注前反復短暫再缺血處理所誘發的一種內源性保護機制。由于IPO操作簡單，時機易于掌握，目前已得到臨床上的高度關注。肺缺血后處理的研究相對較少，其是否可減輕肺I/R損傷還未確定。因此本實驗通過復制IPO模型，即在長時間再灌注以前，采取復灌30s、停灌30s，連續6個循環的處理作為IPO組。結果與I/R組相比，IPO組的病理學改變減輕，肺濕/干重比顯著降低。這些結果提示：IPO同樣可減輕肺I/R損傷。

早期研究多認為肺功能障礙主要與肺組織細胞壞死有關，而近年來的實驗研究[1]卻表明，繼發于I/R的凋亡細胞數量與細胞氧化損傷呈顯著相關。缺血/再灌注后出現的氧化損傷、鈣超載及能量代謝障礙等均會導致細胞凋亡增加。缺血后處理則可通過激發機體自身防護系統而抑制細胞凋亡的發生，如降低線粒體膜通透性、阻止促凋亡蛋白從線粒體向外釋放和抑制Caspases的激活[2]。在本研究中我們發現，I/R組肺組織的細胞凋亡指數顯著高于Sham組，而IPO組的細胞凋亡指數則較I/R組顯著減低。該結果提示IPO具有明顯的抗凋亡作用。

細胞凋亡的發生與Bcl-2和Bax表達密切相關。Bcl-2和Bax都是Bcl-2家族的成員，Bcl-2蛋白家族表達的異常直接調控著凋亡的發生。Bcl-2抑制細胞凋亡的作用與抗氧化、抑制Ca2+內流等因素有關，其通過抑制細胞信號傳遞而發揮抑制細胞凋亡、延長細胞壽命的作用。最近有文獻提出Bcl-2還能抑制趨化因子巨噬細胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）的升高，從而參與I/R后炎癥反應的抑制作用。而Bax基因則可通過對抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用發揮效應。細胞對死亡信號的敏感性取決于胞內Bcl-2/Bax競爭性的二聚體化過程。Bax同二聚體形成便可誘導凋亡；隨Bcl-2蛋白表達量的上升，越來越多的Bax同二聚體分開，與Bcl-2形成比Bax/Bax更穩定的Bcl-2/Bax二聚體，拮抗了Bax/Bax誘導凋亡的作用，則細胞不發生凋亡[2]。從本實驗中我們可以看出：IPO能明顯增加Bcl-2的表達和抑制Bax的表達，使Bcl-2/Bax的比值升高，從而使細胞凋亡指數減少。

綜上所述，本研究顯示缺血后處理能較好保護I/R損傷后的肺組織結構，減輕肺水腫，并且具有顯著的抗凋亡作用。其抗凋亡的機制應該與上調Bcl-2表達與抑制Bax表達，使Bcl-2/Bax的比值升高有關。

[1]Zhang J，Wu Y，Weng Z，et al.Glycyrrhizin protects brain against ischemia-reperfusion injury in mice through HMGB1-TLR4-IL-17A signalingpathway[J].Brain Res，2014，1582：176-186.

[2]Zhang J,Wu Y,Weng Z,et al.Glycyrrhizin protects brain against ischemia-reperfusion injury in mice through HMGB1-TLR4-IL-17A signaling pathway[J].Brain Res,2014,1582:176-186.

[3]董福強,田軼魁,魏民新,張鑫.缺血后處理對大鼠心肌細胞凋亡及Bcl-xl/s的影響[J].天津醫藥,2011(12).

[4]徐曉娜,方蓮花,杜冠華.心肌缺血再灌注損傷過程中Bcl-2調控自噬的研究進展[J].中國藥學雜志,2014(05).

[5]黃婷,李紹旦,楊明會,劉毅.大鼠心肌缺血再灌注實驗技巧的經驗總結[J].中國比較醫學雜志,2017(09).