阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠MMP-2 occludin mRNA的影響

楊會杰 張 娟 夏 昱 孫 環 孟祥光

1)鄭州市第七人民醫院，河南 鄭州 450000 2)河南省人民醫院，河南 鄭州 450000

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是神經科常見病，占腦卒中總發病率80%左右，常常導致患者偏癱、失語、認知功能障礙、精神障礙等嚴重不良事件，因此盡早開通閉塞血管、恢復血流是治療的關鍵。溶栓是首選治療，但臨床中真正受益者不足3%[1]。絕大多數患者發展成局灶性腦缺血，不僅造成神經細胞壞死、凋亡、自噬，而且使血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞，進而導致腦水腫、顱內壓增高、炎癥介質滲出，甚至腦出血，加重腦組織損傷。IgG是血清中一種免疫球蛋白，腦脊液中含量極微，因分子量大無法通過正常BBB，一旦BBB破壞，IgG等一些大分子物質可順利通過，故通過測IgG滲出量可反應BBB破壞程度[2]。目前研究證實，BBB破壞與MMP-2、occludin等分子變化密切相關，但尚不清楚阿托伐他汀在AIS中是否可通過影響MMP-2、occludin mRNA等分子結構保護BBB。鑒于此，本實驗通過建立局灶性腦缺血模型，觀察IgG、MMP-2、occludin mRNA的動態變化，并探討阿托伐他汀對其的影響。

1 材料與方法

1．1主要材料與試劑雄性SD大鼠108只，體質量(300±20)g，購自河南省實驗動物中心(合格證：SCXK(豫)2010-0002)；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，許可證號：H20051407)；OD 值測量儀器(Merinton SMA4000)；羊抗兔IgG抗體(美國Santacruz公司)；RT-PCR試劑盒(北京Transgene公司)等。

1．2方法

1．2．1 分組：將大鼠隨機分為3組，即假手術組、模型組、治療組，每組36只，各組設3個觀察時間點：1 d、3 d、7 d，各個時間點12只。

1．2．2 大腦中動脈閉塞模型制備：實驗前6 h禁食、2 h禁水。參照樂婷等[3]的線栓法制備左側大腦中動脈閉塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，清醒后按Longa 5分[4]進行評分，1～3分為成功模型。假手術組只分離，不結扎，不插線。

1．2．3 給藥：術后3 h，治療組給予阿托伐他汀4 mg/(kg·d)灌胃(阿托伐他汀用5 mL生理鹽水溶解)，持續給藥到相應觀察時間點；假手術組和模型組在相應時間點給予等量生理鹽水灌胃。

1．2．4 標本采集及保存：每組大鼠在相應時間點處死。隨機取6只經心臟灌注40 g/L多聚甲醛后取腦，固定24 h后石蠟包埋保存，用于免疫組化檢測；其余6只斷頭取腦，液氮迅速冷凍后移于-80 ℃冰箱保存，用于RT-PCR法檢測。

1．3檢測指標

1．3．1 免疫組織化染色方法測IgG、MMP-2的表達：大鼠腦組織石蠟切片5 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS沖洗3次，高壓抗原修復5 min，自然冷卻，PBS沖洗3次，滴加一抗50 μL，室溫下孵育1 h；PBS沖洗3次，滴加二抗50 μL室溫孵育15 min，用PBS沖洗3次，加DBA顯色，蘇木素復染，脫水，透明及封片。100倍鏡下觀察，400倍鏡下計數陽性細胞數，采用Image Pro Plus 6.0(IPP)圖像處理系統進行分析，測定平均光密度值(IOD)。

1．3．2 RT-PCR檢測occludin mRNA的表達：按Trizol試劑說明提取腦組織總RNA，先用RNase H處理后，按照RT-PCR試劑盒說明合成cDNA以及PCR 擴增。Occludin引物序列上游為5' ATCTTTGTTACCAGCGTCAT 3'，下游為5' CCTTTAATTCCTGCACCC 3'。以GAPDH作為內參照進行PCR 擴增，引物序列上游為5' TATCGGACGCCTGGTTAC 3'，下游為5'ATGGGAGTTGCTGTTGA-AGT 3'。PCR 擴增條件為：94 ℃預變性2 min，1個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃總延伸6 min終止反應。PCR產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外線投射儀下拍照，用D-140圖像記錄分析系統進行分析，目的基因occludin mRNA的表達量以occludin的DNA條帶和GAPDH的DNA條帶灰度值的比值表示。

2 結果

2．1 IgG免疫組化檢測結果根據析因方差分析結果顯示，不同處理組間IgG免疫組化染色的IOD值差異有統計學意義(F=32 175.048，P<0.001)；不同觀察時間點間IgG免疫組化染色的IOD值差異有統計學意義(F=4 356.426，P<0.001)；處理方法與作用時間之間存在交互作用(F=1 300.979，P<0.001)。進一步兩兩比較發現，在相同觀察時間點，與假手術組相比，模型組和治療組IgG免疫組化染色的IOD值均升高(P<0.001)；與模型組相比，治療組IgG免疫組化染色的IOD值均降低(P<0.001)。見表1。

表1 各時間點3組間IgG免疫組化染色的IOD值測定結果比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2．2 MMP-2免疫組化測定結果根據析因方差分析結果顯示，不同處理組間MMP-2的差異有統計學意(F=20 892.815，P<0.001)；不同觀察時間點間MMP-2的差異有統計學意義(F=4 294.997，P<0.001)；處理方法與作用時間之間存在交互作用(F=1 182.892，P<0.001)。進一步兩兩比較發現，在相同觀察時間點，與假手術組相比，模型組和治療組MMP-2均升高(P<0.001)；與模型組相比，治療組MMP-2均降低(P<0.001)。見表2。

表2 各時間點3組間MMP-2測定結果比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2．3 occludin mRNA的表達情況根據析因方差分析結果顯示，不同處理組間occludin mRNA表達的差異有統計學意義(F=8 330.538，P<0.001)；不同觀察時間點間occludin mRNA表達的差異有統計學意義(F=2 374.073，P<0.001)；處理方法與作用時間之間存在交互作用(F=557.966，P<0.001)。進一步兩兩比較發現，在相同觀察時間點，與假手術組相比，模型組和治療組occludin mRNA表達均降低(P<0.001)；與模型組相比，治療組MMP-2均升高(P<0.001)。見表3、圖1。

表3 各時間點3組間occludin mRNA表達比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

A：假手術組 B：模型組 C：治療組圖1 不同時間點occludinmRNA表達結果 A：給藥后1 d；B：給藥后3 d；C：給藥后7 d

3 討論

AIS是一個多因素、多層次的復雜病理損傷過程，涉及氧自由基、鈣超載、細胞因子、細胞凋亡、炎癥反應、基質金屬蛋白酶激活、線粒體損傷、BBB破壞等多重因素，造成腦組織損傷、神經功能障礙。在AIS中，BBB破壞出現早，持續時間長。研究發現[5]，腦缺血60 min后BBB通透性增加，可持續4～5周[6]，不僅造成病灶側BBB破壞，還造成對側BBB破壞[7]。BBB破壞常造成腦水腫、顱內壓升高、炎癥介質滲出，甚至腦出血，在疾病的發生、發展過程中，扮演著重要角色。因此，保護BBB是治療AIS重要一環。

BBB是一道維持腦組織內環境穩定的高選擇性、低滲性屏障。由兩道屏障構成，第一道屏障是內皮細胞和內皮細胞連接，第二道屏障是基底膜；內皮細胞連接包括緊密連接和黏附連接，緊密連接位于細胞連接的上面，主要有跨膜蛋白、胞漿附著蛋白及細胞骨架蛋白共同組成，跨膜蛋白包括claudin、 occludin、JAM，跨膜蛋白的細胞內部分與胞漿附著蛋白相連，細胞外部分與相鄰細胞的跨膜連接蛋白相互作用，而黏附連接位于細胞連結的基底面，對緊密連接的穩定起著重要的作用[8]，內皮細胞及其間緊密連接是BBB的核心結構。Occludin、claudin-5是緊密連接的主要組成部分[9]，occludin的分布和表達變化直接影響緊密連接功能及BBB通透性，是評價BBB功能的一項敏感指標[10]。在正常腦組織中，基質金屬蛋白酶( matrix metallo proteinases，MMPs)以低表達量無活性的酶原形式存在，MMPs的活性與其轉錄、翻譯、酶原激活、金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)密切相關，并且MMPs與TIMPs維持著動態平衡。AIS可促進MMPs激活，特別是MMP-2和MMP-9激活，可降解BBB的內皮細胞連接和基底膜，加重腦組織損傷[11]，MMP-2可直接降解occludin使BBB破壞。

本研究發現，與假手術組相比，模型組和治療組的IgG滲出量隨時間延長先升高后降低，在第3天達到高峰，且差異有統計學意義(P<0.05)，提示腦缺血后BBB通透性增加且在第3天最嚴重；MMP-2隨缺血時間延長先升高后降低，而occludin mRNA表達隨缺血時間延長先減低后升高，均在第3天達峰，且差異有統計學意義(P<0.05)。MMP-2活性增加可直接破壞內皮細胞連接蛋白和基底膜，occludin mRNA表達減少是內皮細胞緊密連接進一步受損，故BBB損傷與MMP-2活性增加和occludin mRNA表達減少密切相關。

阿托伐他汀安全性高、耐受性好，是AIS的一線用藥，除了調脂、穩定斑塊外，還具有抗炎、促進血管再生、促進神經元再生、抗凋亡、抗自噬、抗自由基等多種腦保護作用。在腦缺血模型中，研究發現阿托伐他汀可抑制claudin-5蛋白降解保護BBB[12]。Lischper等[13]研究發現，MMP-2抑制劑可通過抑制MMP-2活性，阻止occludin蛋白降解保護BBB。但是，目前尚不清楚然阿托伐他汀是否通過影響MMP-2、occludin mRNA等分子結構保護BBB，鑒于此，本實驗通過建立MCAO大鼠模型，觀察阿托伐他汀對缺血后大鼠腦組織MMP-2、occludin mRNA的影響。結果顯示，與模型組相比，治療組IgG滲出量減少，且差異有統計學意義(P<0.05)，提示阿托伐他汀具有保護BBB作用；MMP-2在腦缺血后各個時間點均減少，而occludin mRNA表達在各時間點均增多，且差異有統計學意義(P<0.05)，提示阿托伐他汀可抑制MMP-2活性減少內皮細胞連接蛋白和基底膜破壞，促進occludin mRNA表達使內皮細胞緊密連接更加穩固。由此我們可認為阿托伐他汀可能通過抑制MMP-2活性，提高occludin mRNA表達減輕BBB破壞，減少水分子、炎癥介質滲出，起到保護腦組織作用。

總之，本實驗表明局灶性腦缺血可造成BBB破壞，并呈動態變化，表現在第3天最嚴重，與MMP-2活性增加、occludin mRNA表達減少密切相關。阿托伐他汀可通過抑制MMP-2活性，增加occludin mRNA表達，影響BBB的超微分子結構，起到腦保護作用，進一步闡明了阿托伐他汀保護BBB的相關分子機制。

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