U87膠質瘤裸鼠皮下移植瘤模型建立

汪柳旭 朱鳳軍 廖建湘 段 婧 陳 乾 宋建明

深圳市兒童醫院 1)神經內科 2)神經外科 3)病理科，廣東 深圳 518038

神經膠質瘤簡稱膠質瘤，起源于神經膠質、室管膜、脈絡叢上皮、神經元等，占顱內腫瘤40%，病因至今未明[1-2]。兒童神經膠質瘤發病率約占顱內腫瘤的40%，是兒童最常見的顱內惡性腫瘤[3]。目前多采用手術聯合放療、化療共同治療膠質瘤[4-6]，由于膠質細胞異質性，可能導致治療效果不佳[7]。兒童神經膠質瘤早期發病時臨床癥狀較輕微，確診時多是腫瘤晚期，且兒童對手術、放療、化療等綜合治療的耐受性差，預后極差[8]。臨床上需要尋求新的有效控制神經膠質瘤生長的方法。通過建立成功的膠質瘤動物模型，為兒童神經膠質瘤治療提供有效的研究平臺。

紅外成像技術是指運用光電技術檢測物體熱輻射的紅外線特定波段信號，將該信號轉換成可供人類視覺分辨的圖像和圖形，并計算出溫度值[9]。醫用紅外成像就是利用正常組織與病變組織的溫度差異而形成不同的紅外圖譜，從而實現早期診斷。紅外成像的優點是沒有損傷、準確度高、反應靈敏、操作簡便[10]。研究表明，紅外成像技術可以早期發現腫瘤[11]，最早用于乳腺癌的診斷。本實驗建立U87膠質瘤裸鼠皮下移植瘤模型，利用紅外成像技術，成瘤初期開始觀察裸鼠腫瘤體積生長情況及腫瘤溫度隨時間變化情況。

1 材料與方法

1．1主要試劑及儀器DMEM培養液(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，新生小牛血清(澳洲GenStar公司)，PBS緩沖液(美國HyClone公司)，GFAP抗體(美國BioGenex公司)，DAB試劑盒(美國Ventana Medical Systems公司)，蘇木精液(深圳達科為生物技術有限公司)，1%伊紅液(深圳達科為生物技術有限公司)，中性樹膠(深圳達科為生物技術有限公司)。水套式二氧化碳培養箱(美國Nuaire公司)，超凈工作臺(日本Airtech公司)，生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)，紅外熱像儀(廣州颯特紅外熱像儀公司)。

1．2接種細胞和實驗動物U87膠質瘤細胞株由中國科學院深圳先進技術研究院實驗室提供。雌性Balb/c裸鼠10只，鼠齡4～6周，體質量15～20 g，由廣東省醫學動物中心提供(實驗動物許可證號：SCXK粵2013-0002)，在無特定病原體(specified pathogen-free，SPF)條件下飼養，室溫26～28 ℃，濕度40%～60%，用高壓滅菌的飲用水和飼料定期喂養。

1．3裸鼠皮下移植瘤模型建立U87細胞在含有10%新生兒小牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養基中，5% CO2孵箱、37 ℃條件下培養至對數生長期。取對數生長期細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后，離心去上清液，用無血清DMEM培養液離心洗滌2次，計數細胞數，調整細胞濃度，將U87細胞懸浮于無血清DMEM培養液中，細胞濃度為1×107個/100 μL。用帶6號針頭的1 mL注射器抽取混勻的細胞懸液100 μL，接種于裸鼠右側背部靠右后肢皮下處。接種第12天，所有裸鼠腫瘤體積>100 mm3。

1．4裸鼠移植瘤生長曲線的測定每日觀察裸鼠精神、飲食、排便及活動情況，自接種第3天起每隔3 d稱質量并用游標卡尺測量移植瘤體的長徑(a)、短徑(b)，按體積公式V=1/2(a×b2)計算移植瘤平均體積，求其平均值并繪制腫瘤生長變化曲線。

1．5 HE染色接種第36天處死裸鼠取出腫瘤，肉眼觀察移植瘤形態、質地、活動度。用10%福爾馬林固定腫瘤組織，石蠟包埋，組織切片常規脫蠟水化后，蘇木素染色5 min，自來水沖洗3 min，伊紅液染色3 min，自來水沖洗3 min，脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。

1．6 GFAP免疫組化組織切片經PBS洗滌后脫蠟、脫水，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，切片浸入檸檬酸鹽抗原修復液中，微波爐加熱，10%山羊血清封閉非特異性結合位點，加一抗(GFAP 1：50)，4 ℃過夜，加二抗(1：100)，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片。

1．7紅外熱像成像接種第6天及其后每間隔3 d測量一次紅外熱儀圖像，采用CK350-M制冷型紅外熱像儀，每次測量日于15：00～17：00測量。測量時將裸鼠尾部及四肢固定于拍攝板，取腫瘤側(右側位)進行拍攝，紅外熱像儀與拍攝物體間每次距離為40～50 cm。將拍攝的圖像用SatMedical V2.0.3軟件處理后計算出腫瘤溫度。

2 結果

2．1裸鼠生長情況及腫瘤生長曲線接種初期，裸鼠食欲正常，體質量有所增加；接種第12天時，肉眼可見裸鼠皮下有一黃豆大小的腫塊。在接種30 d以后，腫瘤大小增加明顯，裸鼠逐漸消瘦，行動稍顯遲緩，食欲減退。接種第36天處死裸鼠，所有裸鼠形成皮下移植瘤(圖1A)。根據測量的腫瘤長徑、短徑計算出腫瘤體積，繪制出膠質瘤體積生長曲線圖(圖1B)。接種第36天時(即腫瘤處死時)腫瘤體積(1 397.6±205.8)mm3。

2．2紅外成像所測腫瘤溫度變化用SatMedical V2.0.3軟件處理后計算出腫瘤溫度，繪制腫瘤溫度曲線(圖2A)。如圖2中接種第36天裸鼠腫瘤溫度與接種第6天比較差異有統計學意義(P<0.05)，腫瘤生長初期溫度高于腫瘤生長后期溫度。在接種初期，當肉眼不能明顯觀察腫瘤形態時，可以借助紅外熱像儀攝圖了解腫瘤情況(圖2B)。

2．3病理學特征

2．3．1 HE染色結果：接種第36天處死裸鼠取出腫瘤，顯微鏡下腫瘤標本HE染色顯示腫瘤細胞符合膠質瘤細胞形態特點(圖3A)。

2．3．2 GFAP免疫組化結果：腫瘤組織經GFAP染色后，顯微鏡下觀察腫瘤細胞GFAP陽性表達，證實腫瘤標本為膠質源性腫瘤(圖3B)。

3 討論

裸鼠腫瘤模型常作為研究人類腫瘤生物特性以及腫瘤治療的實驗模型[12]，其可以保留原發腫瘤本身的形態特征及遺傳性。動物腫瘤模型中的移植性腫瘤模型應用廣泛[13-16]，該模型成瘤率高，均一性好，準確反映腫瘤的生物學特性。裸鼠皮下移植瘤模型操作簡單，便于觀察。本實驗通過培養膠質瘤細胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，為膠質瘤治療的相關研究提供可靠的動物模型。目前移植性腫瘤動物模型較多使用Balb/c-nu裸鼠，源于該鼠無胸腺，細胞免疫功能低下，異種移植的排斥反應較低[17]。Balb/c裸鼠為先天性免疫胸腺缺陷小鼠，T淋巴系統缺失。裸鼠常作為腫瘤體內耐藥性和腫瘤細胞成瘤性的研究對象。U87MG細胞株來源于人類膠質瘤，與多形性膠質母細胞瘤類似，U87細胞常用于膠質瘤腫瘤的研究[18]。

圖1 A：接種第36天裸鼠膠質瘤組織，肉眼可見腫瘤組織呈結節狀、灰白色，大小形態不規則，與周圍皮膚不粘連；B：10只裸鼠膠質瘤體積生長曲線 接種初期腫瘤生長緩慢，接種21 d以后，腫瘤開始快速生長

圖2 A：10只裸鼠腫瘤溫度曲線圖 接種初期，腫瘤溫度逐漸上升，到接種第15天時腫瘤溫度最高，而腫瘤生長到一定體積后，隨著腫瘤的生長，腫瘤溫度逐漸下降；B：1號裸鼠膠質瘤紅外成像特征圖 截取裸鼠右側腫瘤側區域進行紅外攝圖，初期腫瘤區域呈現高溫(紫色)，隨著腫瘤的生長，腫瘤溫度逐漸下降，呈現黃色，后期腫瘤產熱量明顯小于初期，呈現藍綠色

圖3 A：裸鼠膠質瘤組織病理學改變(HE染色，×100) 腫瘤細胞排列致密，分布均勻，細胞核呈圓形或橢圓形，細胞核染色程度深，胞漿染色相對較弱；B：裸鼠膠質瘤組織GFAP的表達(免疫組化×200) 陽性細胞的胞漿內呈棕黃色染色(箭頭所示)，胞核無陽性著色，GFAP陽性表達呈棕黃色

膠質纖維蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是膠質纖維的特異性標記物，臨床常用于膠質瘤的確診[19]。GFAP陽性表達程度有助于評估腫瘤組織的惡性程度。本實驗中，所有腫瘤標本GFAP染色均陽性表達，證實所形成腫瘤為膠質源性腫瘤。

同正常細胞相比，腫瘤細胞在生長初期新陳代謝快速，腫瘤細胞的生長速度高于其凋亡速度，短時間內腫瘤迅速增殖到相當大的數量，其在生長過程中的發熱量高于正常組織。由于其他因素的限制導致腫瘤生長所需的營養供給不足，腫瘤生長到一定階段后，生長開始趨于緩慢，腫瘤生長后期產熱量低于腫瘤生長早期[20]。本實驗表明，利用紅外成像系統，可以早期發現膠質瘤，分析裸鼠成瘤情況及是否出現轉移等情況，對腫瘤生長進行無創監測。近年來，紅外熱像技術廣泛用于乳腺疾病、惡性腫瘤、炎癥、深靜脈血栓等的早期發現[21-25]，不同于CT、MRI、B超等影像檢查，紅外熱像技術操作簡便、無創，能夠更早發現機體的病理變化，動態觀察體表溫度變化，對疾病進行早期診斷、治療、干預。由于紅外成像的多種優點，有待于廣泛應用于臨床醫學領域。

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