自噬與腫瘤干細胞的研究新進展*

龍梅芳，熊 芳 綜述，葉小群 審校

(南昌大學第二附屬醫院呼吸內科,南昌330006)

自噬(autophagy)是一種高度保守的分解代謝過程，是細胞非選擇性的降解和吞噬細胞質中受損變性的蛋白、脂質、細胞器及細胞內病原體，并利用降解產物供能和提供原料等，從而促進細胞生存并維持穩態[1]。在不同種類的腫瘤及腫瘤發展的不同階段中，自噬發揮著促進和抑制兩種不同的影響，通過激活和抑制自噬可以提高腫瘤的療效[2]。腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是一種具有自我更新、多向分化和無限增殖潛能為特征的未成熟細胞，與腫瘤的發生、發展、轉移及耐藥有密切相關。這一理論為篩選靶向殺傷腫瘤干細胞的藥物，提高藥物對腫瘤的療效，提供了理論依據[3]。自噬在腫瘤干細胞的生物學活動中亦起著重要作用，現今仍在不斷探索中，本文將對自噬及其在腫瘤和腫瘤干細胞中的作用進行綜述。

1 自噬

自噬是所有真核生物所特有的一種古老的生物學現象，過去70年來一直在研究[4]。研究發現，自噬有兩種不同的分類方法：(1)根據自噬對降解底物的選擇不同，將自噬分為選擇性自噬(例如在營養剝奪期間)和非選擇性自噬(例如在病原體侵襲或細胞器受損時)[5]。(2)根據細胞內底物運送到溶酶體的方式不同，分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。

目前，自噬的信號通路包括：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin mTOR)信號轉導通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase P13K/Akt)信號轉導通路、活性氧類(reactive oxygen species,ROS)信號轉導通路、NF-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)信號轉導通路等。

正常生理情況下，大多數細胞中的自噬維持在較低的水平。當細胞內、外受到應激源刺激時，自噬可以顯著增加，使細胞更好地適應這些改變[6]。應激源包括饑餓、缺氧、細胞內病原體的感染等。在營養物質被剝奪情況下，自噬能為細胞提供代謝中間體來滿足生物能量需求。DU等[7]研究發現，在葡萄糖營養剝奪的情況下，發現小鼠的心肌細胞中出現大量的自噬現象，減少因營養物質缺乏出現心肌細胞死亡 ；在缺氧期間，自噬可清除細胞質內過多的活性氧(ROS)，從而減輕給細胞造成的氧化損傷；CHEN等[8]表明在缺氧環境下番茄紅素(抗氧化劑)可誘導自噬保護心肌細胞免于凋亡，研究者通過基因沉默Bclin1,破壞自噬，同樣劑量下的番茄紅素，缺氧環境下出現心肌細胞大量凋亡，驗證了作者的推測。當病原體入侵后，細胞自噬通過膜結構包裹病原體形成自噬泡，進而與溶酶體融合降解，這個過程稱為異自噬(xenophagy)，代表了“最先進”的免疫效應機制[9]。在一般外界應激源刺激下，自噬可以促進細胞存活，當自噬不適時的發生或過度激活,則會導致非程序性細胞凋亡(自噬性細胞凋亡)。研究表明神經節苷脂治療病理狀態下的神經膠質細胞時，可通過ROS 介導神經膠質細胞自噬性凋亡，從而維持內環境的穩定[10]。

2 腫瘤中自噬表現的兩面性

自噬與各種生理病理過程和人類疾病密切相關，在腫瘤中的作用已被廣泛研究，其可抑制早期腫瘤的發展，但也會促進晚期腫瘤的轉移，起著一把“雙刃劍”的作用[2]。(1)早期腫瘤階段中的自噬，20世紀80年代科學家就已經發現，腫瘤細胞的自噬能力與周圍細胞相比，處于較低的水平。研究證明，自噬的缺陷導致受損蛋白質和細胞器的累積，誘導細胞產生應激反應，進而導致基因損傷、染色體不穩定、慢性組織損傷等，這些因素在腫瘤的起始階段和腫瘤的轉化過程起著重要的作用[11]。在研究特異性敲除ATG5的動物小鼠模型中，損傷的小鼠肝細胞誘發氧化應激和DNA損傷，因為自噬能力缺陷，不能有效的清除損傷的細胞器和蛋白質，累積的氧化損傷引起脂肪變性，最后誘發肝癌[12]，表明自噬可抑制腫瘤的發生。(2)研究發現晚期腫瘤階段中的自噬，當腫瘤面對氧化應激，如：缺氧、pH改變、營養物質剝奪，自噬可以緩解細胞代謝壓力，維持細胞活性，可以認為，自噬是腫瘤細胞的生存機制之一[13]。通過體內模型實驗發現，自噬通過維持線粒體的結構和功能，維持腫瘤代謝，促進腫瘤生長[14]。YANG等[15]研究胰腺癌轉移模型中發現，胰腺癌與自噬有明顯的依賴關系，自噬在胰腺癌中的水平明顯更高，當用氯喹抑制自噬后，小鼠模型胰腺瘤消退，存活時間延長。該研究說明自噬可促進癌癥的進展。

3 正常干細胞中的自噬

干細胞是指具有增殖、自我更新能力及多向分化潛能的未分化細胞。研究發現自噬參與多種干細胞的調節[16]。OU等[14]研究表明自噬可以減緩氧化應激，促進胚胎干細胞的存活。研究者利用高濃度的H2O2(1 mM)誘導人胚胎干細胞發現了細胞凋亡。然而，添加3-甲基腺嘌呤(自噬抑制劑)與H2O2的組合發現人胚胎干細胞出現更多的凋亡。目前，國內外對造血干細胞中自噬的研究較少，現有研究表明自噬在造血干細胞中高度活躍，調控造血干細胞的靜息、自我更新和分化的動態平衡[17]。如果這個平衡被打破，貧血、淋巴細胞減少、骨髓增生或造血惡性腫瘤(如白血病)等疾病將會接踵而來。研究發現自噬可以保護間充質干細胞，HOU等[18]發現輻射可以誘導活性氧(ROS)積累，導致間充質干細胞損傷。饑餓或雷帕霉素誘導的自噬，可以減少ROS的積累和DNA損傷并維持間充質干細胞的干性。 此外，抑制自噬導致ROS積累和DNA損傷的增加，則導致間充質干細胞的干性喪失。

4 腫瘤干細胞中的自噬

腫瘤干細胞能通過自我更新和無限增殖維持腫瘤細胞群的生命力,最近的研究證明，自噬對腫瘤干細胞的存活及其耐藥有關鍵作用。

4.1結腸癌干細胞與自噬 結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一[19]。常規的抗癌治療(放射/化學療法)主要是殺死腫瘤中大部分快速增殖的癌細胞，但可以保留相對靜止的腫瘤干細胞。KWATRA等[20]研究發現來自苦瓜中的甲醇提取物可通過激活自噬來抑制結腸癌干細胞存活，進而提高化學藥物對結腸癌的療效。文獻描述姜黃素可抑制腫瘤干細胞的自我更新，從而使耐藥性腫瘤干細胞重新對藥物敏感[21]。但KANTARA等[22]發現DCLK1陽性結腸癌干細胞亞型可抵抗姜黃素的毒性作用。姜黃素通過啟動自噬過程(誘導酸性囊泡的形成，募集LC3到自噬體，增高Bclin1的表達)從而減弱殺傷結腸癌干細胞的能力。DCLK1-siRNA沉默后自噬相關蛋白表達減少，結腸癌干細胞凋亡增多。由此猜測DCLK1-siRNA聯合姜黃素將可能成為治療結腸癌的新療法。上述研究表明，激活自噬有利于結腸癌干細胞的存活，抑制自噬可提高腫瘤干細胞對化療藥物的敏感性，提高抗結腸癌的療效。

4.2肝癌干細胞與自噬 國內外對肝癌的基礎研究中，肝癌干細胞的研究一直備受關注，這群細胞雖僅占肝癌細胞很小的比例，但它具有很高的致瘤性、轉移能力和耐藥性，在肝癌的發生、發展中扮演了重要的角色。肝癌常處于低氧低營養的腫瘤微環境中。肝癌干細胞是如何調控肝癌細胞適應這種微環境的機制尚不清楚。SONG等[23]研究表明，自噬有助于CD133陽性肝癌干細胞在低氧和低營養的腫瘤微環境中的存活。研究者發現在低氧和低營養情況下，CD133陽性肝癌細胞系比例增加，肝癌干細胞的干性更強，自噬囊泡和LC3自噬蛋白比例更多，凋亡比例更少；加入自噬抑制劑氯喹后，自噬水平下降，CD133陽性肝癌干細胞的凋亡數量明顯增多，自我更新能力減弱。LI等[24]研究發現，CD133陽性的肝癌干細胞可誘導自噬抵抗干擾素-γ(IFN-γ)的免疫監控。ATG5自噬蛋白敲低后可阻止肝癌干細胞誘導自噬，減弱肝癌干細胞增殖能力，增強干擾素-γ免疫殺傷作用。上述兩個例子表明自噬可保護肝癌干細胞。因此，猜測抑制自噬可增強肝癌干細胞對放化療的敏感性，改善抗癌療效。

4.3胰腺癌干細胞與自噬 胰腺癌是惡性腫瘤中致死率最高、為數不多的發病率與病死率幾乎相等的惡性腫瘤之一，近期研究表明，由OPN/NF-κB信號通路介導的自噬可維持胰腺癌干細胞的活性[25]。實驗發現自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ與胰腺癌干細胞標志物醛脫氫酶1(ALDH1)、CD44、CD133的表達呈正相關，通過沉默ATG5，ATG7和BECN1或加入自噬抑制劑氯喹阻斷自噬，在體外和體內中具有ALDH1活性的腫瘤干細胞群體表達降低，對吉西他濱的抵抗力減弱。ZHU等[26]研究發現間歇性缺氧條件下由缺氧因子-1α誘導的自噬可促進胰腺癌干細胞的轉移和侵襲。自噬相關蛋白(LC3和Bclin1)和上皮間質轉化(EMT)相關標志物(E-鈣黏蛋白，波形蛋白和N-鈣黏蛋白)表達水平高于常氧組，同時沉默缺氧因子-1α和抑制自噬后，胰腺癌干細胞的侵襲能力明顯下降。SINGH等[27]研究表明，羅特林通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導自噬促進胰腺癌干細胞的存活。由此筆者猜測，抑制自噬可增強胰腺癌干細胞對化療的敏感性，減弱胰腺癌的侵襲能力。

4.4前列腺癌干細胞與自噬 根據國內外研究發現，在世界范圍內，前列腺癌的發病率存在明顯地理和種族差異，在歐洲和美國，前列腺癌占男性惡性腫瘤發病率的第2位，亞洲國家的發病率遠低于歐洲國家，但近年來呈現上升趨勢[28]。前列腺癌干細胞在癌癥起始、進展和耐藥中起主要作用。然而，在前列腺干細胞中誘導自噬的分子機制尚不清楚。KUMAR等[29]研究羅特林(一種抗過敏和蠕蟲的藥物，現在可用于癌癥的治療)通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導前列腺癌干細胞的自噬和凋亡。在羅特林的誘導下，發現前列腺癌癥干細胞出現大量的凋亡，同時通過電鏡等技術觀察前列腺癌干細胞出現大量的自噬顆粒；利用RNAi技術沉默Beclin-1和ATG-7的表達，自噬能力減弱，前列腺癌的凋亡速度減緩，研究證實羅特林誘導前列腺癌干細胞凋亡是誘導自噬實現的。

4.5膀胱癌干細胞與自噬 膀胱癌是男性排名第4，女性排名第9的最常見的癌癥，是全球發病和病死的主要原因[30]。自噬是實體瘤耐藥性的關鍵因素。然而，自噬調節膀胱癌干細胞的機制尚不清楚。OJHA等[31]研究發現，通過普通膀胱癌細胞(T24)和耐藥的膀胱癌干細胞(RT24)對比發現，在吉西他濱(GC)和絲裂霉素(MM)化療藥物的誘導下，T24的細胞凋亡率明顯大于 RT24，檢查自噬通量的表達，RT24中LC3Ⅱ/Ⅰ高于T24；使用渥曼青霉素(PI3K自噬抑制劑)阻斷GC或MM誘導的自噬，增加了膀胱癌干細胞的凋亡數量，進一步用siRNA方法敲除了自噬基因Beclin1實驗結果相似。實驗表明，氯喹聯合吉西他濱、米霉素兩種化療藥物，可以抑制膀胱癌細胞的生長、發育、成熟。自噬在膀胱癌干細胞的自我更新、分化、成瘤性、化療敏感性等方面發揮重要作用，因此自噬抑制劑的應用有望成為膀胱癌新的治療措施。

4.6肺癌干細胞與自噬 肺癌的發病率和病死率在近50年來明顯上升，20世紀末，肺癌已成為發病率和病死率均居全球首位的惡性腫瘤[32]。迫切需要了解肺癌細胞的發生、發展和耐藥等機制，為患者尋求更有效的治療方法。近期研究表明肺癌干細胞利用自噬機制來維持肺癌的存活、耐藥和復發。YANG等[33]從A549肺癌細胞株中分離肺癌干細胞并且抑制自噬來增強順鉑的細胞毒作用，給肺癌的治療帶來的新的方向。研究者使用熒光激活細胞分選儀(FACS)分離的SP(slide population cells)細胞中,發現MDR1和ABCG2的表達顯著上調，說明具有干細胞的特性。在普通培養條件下，肺癌干細胞的自噬水平低于肺癌細胞，然而在順鉑作用下，肺癌干細胞的自噬水平明顯上升，Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達上調，凋亡能力低于普通的肺癌細胞。使用3-磷酸腺苷(3-MA)自噬抑制劑后，發現SP的凋亡比例明顯上升。實驗結果表明，自噬有助于A549肺癌SP細胞對順鉑的耐藥能力，自噬可能是肺癌治療中具有吸引力的靶點。

5 結語與展望

腫瘤的治療的一直以來是全球不斷努力攻克的難題。研究發現，在腫瘤的發生、發展中，自噬和腫瘤干細胞發揮著重要作用，二者對腫瘤的治療也起著關鍵的作用。研究表明，在腫瘤治療中，腫瘤干細胞中的自噬起著一把“雙刃劍”的作用。在抗腫瘤治療時，自噬起著協同作用，誘導腫瘤干細胞自噬性凋亡；而在耐藥腫瘤細胞中，自噬卻起著拮抗作用，保護腫瘤干細胞，抵抗化療藥物的毒性作用。目前對腫瘤干細胞中自噬的調節機制的研究尚少，腫瘤干細胞自噬研究的突破，將會為腫瘤治療提供新的理論依據。