NK細胞在HIV感染中的作用：進展和展望

曾永秦，逄曉莉，汪 笛，李 蓓，樊立娜，郝 禹，李國立，杜 娟，趙紅心

1 NK細胞的表型及功能

NK細胞占外周血淋巴細胞總數的10%～15%[1]26。NK細胞由造血干細胞發育而來，其比例以肺＞肝臟＞外周血＞脾臟＞骨髓＞淋巴結＞胸腺的順序分布，總數以脾臟＞肺＞骨髓＞外周血＞淋巴結＞肝臟＞胸腺的順序分布[2]。人與小鼠的NK細胞有所區別。根據CD27/CD11b的表達，可將小鼠NK細胞的發育分成CD11bloCD27lo，CD11bloCD27hi，CD11bhiCD27hi，CD11bhiCD27lo4個發育階段。而應用CD117、CD161、NKp46、CD56 4種抗體，可將人類NK細胞的發育粗略分為CD117+CD161-NKp46-CD56-，CD117+CD161+NKp46+CD56-，CD117-CD161-NKp46+CD56+[1]27-283個階段。成熟階段的NK細胞又可根據表面分子CD56、CD16表達密度的不同分為 CD56dimCD16+、CD56brightCD16-、CD56negCD16+3個亞群[3-5]。CD56dimCD16+NK細胞亞群占外周血NK細胞的90%，可介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC），胞內顆粒成分多，以殺傷功能為主；CD56brightCD16-NK細胞亞群占外周血NK細胞的10%，是次級淋巴器官中的主要NK細胞亞群，以分泌細胞因子為主；而正常人外周血中檢測不到或僅有極少量的CD56negCD16+NK細胞亞群，且體外研究發現，該NK細胞亞群的殺傷能力及細胞因子分泌能力均低于前兩群[6-7]。

NK細胞兼具殺傷功能與細胞因子分泌功能。NK細胞的功能通過細胞表面表達的多種受體實現自我調節控制[8-9]。NK細胞表面表達如黏附分子、趨化因子受體、細胞因子受體、NK細胞受體等多種分子，從功能角度可將NK細胞表面受體分為活化性受體和抑制性受體，NK細胞抑制性信號與活化信號之間的平衡決定了NK細胞與靶細胞的相互作用。正常情況下，靶細胞表面自身主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex,MHC）I類分子與NK細胞表面抑制性受體結合產生抑制信號，抑制NK細胞活化，保護靶細胞免受NK細胞攻擊[10]。病理情況下，兩種受體間的平衡被打破，NK細胞可對靶細胞產生殺傷作用[11]。活化性受體包括天然細胞毒受體、NKG2家族分子如NKG2D及殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR）-S（短型），抑制性受體家族包括NKG2A和KIR-L（長型），其中KIR2DL同時具有活化和抑制的潛能[12]。

識別靶細胞后，NK細胞對其發揮殺傷功能的方式也有3種。①通過NK細胞胞漿含有的顆粒成分，包括一些蛋白質如穿孔素和蛋白酶如顆粒酶直接裂解靶細胞[13]；②通過NK細胞表達的Fc段受體（CD16）識別與抗原結合的抗體，進而釋放細胞溶解顆粒發揮ADCC[14]；③通過一些細胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和趨化因子受體5等誘導NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α來控制病毒感染（IFN-γ可以激活巨噬細胞進行吞噬和裂解，TNF-α可以直接促進NK細胞及CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷）。

2 NK細胞的耗竭

NK細胞在HIV感染和進展中起著重要作用，在對NK細胞功能的研究中，NK細胞功能的耗竭是其中一個研究熱點。耗竭通常用于描述免疫細胞功能障礙的狀態，其特征為免疫細胞效應功能降低。目前，對于T細胞的耗竭狀態研究較多，其具有以下特點：耗竭伴隨著表型變化[15]，表觀遺傳修飾[15]和轉錄譜的改變[16]，有多種負調節途徑參與T細胞的耗竭[17]，例如，免疫調節細胞因子和程序性細胞死亡蛋白-1（programmed death-1,PD-1）。這些對研究NK細胞的耗竭提供了思路。例如，①在腫瘤患者中， PD-1在NK細胞上表達增多，而 PD-1的過表達會導致NK細胞對細胞因子的反應性降低[19]，脫顆粒的能力受損[18-19]，細胞因子產生不良[18-20]，增殖能力降低，這表明PD-1信號傳導可抑制NK細胞[19]。②在腎細胞癌中，外周血中NK細胞上PD-1表達增加與疾病階段相關，手術切除原發腫瘤后，PD-1的表達迅速顯著降低[21]。這些數據表明PD-1與NK細胞的耗竭狀態緊密相關。③在對小鼠腫瘤模型的研究中發現，含Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory domains, TIGIT）與NK細胞的耗竭相關，阻斷TIGIT可防止NK細胞耗竭[22]。④在肝細胞癌中，高水平表達的NKG2A與NK細胞的耗竭相關，且IL-10可誘導NKG2A的表達，阻斷IL-10可特異性抑制NKG2A的表達[23]。⑤在轉移性黑素瘤患者中，T細胞免疫球蛋白與粘蛋白結構域-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3, TIM-3）可作為晚期黑色素瘤中NK細胞耗竭的標志物[24]，可通過TIM-3靶向治療，逆轉NK細胞的耗竭表型，改善NK細胞的功能[25]。在病毒感染患者中，TIM-3被證明是NK細胞的抑制性受體[26]。如在慢性乙型肝炎患者外周血的NK細胞中，TIM-3的表達上調[27]，并抑制了這些患者NK細胞的細胞毒性[27]，證明了TIM-3是NK細胞的抑制性受體，提示TIM-3可能參與了NK細胞的功能耗竭。由于這些結果大部分來源于對腫瘤患者的研究，在HIV感染者中，NK細胞表達共抑制分子的情況是否相同仍待進一步研究。

目前對HIV感染及腫瘤患者的NK細胞功能研究可能提示，在HIV感染過程中，大量擴增的CD56negCD16+NK細胞亞群可能是NK細胞的耗竭形式，其分泌細胞因子與殺傷功能都顯著下降。引起NK細胞耗竭的因素有以下幾種：①癌癥患者NK細胞內細胞溶解分子（如顆粒酶、穿孔素、凋亡相關因子配體和TNF相關凋亡誘導配體）的低表達[28]，可使細胞溶解活性降低；②在HIV感染者中，NK細胞活化性受體NKG2D及其下游信號分子DAP10表達的減少，或由IL-10引起的抑制性受體NKG2A表達的上調都可引起NK細胞功能的耗竭[29]；③某些共抑制分子表達增多導致NK細胞功能耗竭。

總之，對可引起NK功能耗竭的分子特征的深入研究，不僅提供了對此種免疫狀態下NK細胞生物學效應的解釋，更可發現一些基于NK細胞的抗腫瘤、抗感染的治療靶點及免疫療法。

3 HIV感染引起NK細胞亞群分布與功能的改變

HIV感染細胞后，可使細胞表面MHC-I類分子表達下調，從而逃避CD8+T細胞的殺傷作用，理論上這會導致NK細胞啟動“缺失自我”機制對靶細胞進行殺傷[30]，但事實并非如此。HIV僅選擇性下調人類白細胞抗原（human leucocyte antigen, HLA）-A、HLA-B，但仍保留HLA-C、HLA-E分子的表達，從而同時逃避CD8+T細胞和NK細胞的殺傷[31]。除了使被感染細胞的分子表達發生改變，HIV還能對NK細胞產生影響。

許多研究表明隨著HIV感染者病程的進展，NK細胞會出現不同程度的數量減少和功能缺損，這可體現在NK細胞表達分子如CD56及表達的受體改變上。例如，在HIV急性感染期中唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素陽性（Siglec-7+）的NK細胞，因Siglec-7表達的明顯下調出現Siglec-7-CD56dimNK細胞亞群，而其余方面并無明顯改變。在HIV慢性感染中，在病毒血癥的持續作用下，NK細胞的數量和功能的改變更為顯著。

如表1所示，功能上無反應性的CD56negCD16+NK細胞亞群的擴增以及主導免疫監視作用的CD56dimCD16+NK細胞亞群的大量減少可能是NK細胞功能受損的主要原因[39]。同時，CD56brightCD16-NK細胞亞群介導的免疫調節功能的異常也會影響適應性免疫功能的正常發揮。所以NK細胞數量的減少和功能的受損可能在HIV感染后期整個免疫系統調節紊亂，功能耗竭，最終進展為AIDS的過程中扮演了重要角色。

4 NK細胞在HIV感染中的作用

在HIV感染中，NK細胞不同程度地通過3種方式對機體起到保護性作用，了解其發生機制可為HIV的治療提供新的思路和方向。

4.1 受體調控的殺傷作用 一方面，利用細胞因子、造血生長因子和免疫調節劑可以促進NK細胞加強殺傷分子如穿孔素、顆粒酶的表達和功能。另一方面， NK細胞的功能受活化性受體和抑制性受體的調控。此外，活化性受體的表達往往與更緩慢的疾病進展相關：①研究發現，在HIV感染個體中，活化性受體KIR3DS1和HLA-Bw4-80I（在位點80處具有異亮氨酸的HLA-Bw4抗原）與更緩慢的疾病進展相關[40]。同時，對HIV急性感染攜帶HLA-Bw4-80I個體的體外病毒抑制和擴增實驗研究也證實了KIR3DS1+NK細胞對HIV進展有抑制作用[41-42]。盡管具體機制尚不清楚，但KIR3DS1+NK細胞可減緩HIV感染患者的疾病進展是明確的。此外，在HIV感染的Bw4-純合個體中，KIR3DL1-CD69+NK細胞的數量與病毒載量設定點呈負相關，并且大量早期激活和增殖的KIR3DL1-CD69+NK細胞在急性HIV感染中起到保護作用，是延緩疾病進展的潛在因素[43]。②NK細胞表達的CD226分子，在與其配體CD112及CD155結合后，能提高NK細胞的殺傷活性。研究發現，在HIV感染人群中，CD226的表達明顯高于正常人[44]，這說明它對HIV感染的免疫應答起到了作用，但具體功能和機制還須進一步探索。在多發性骨髓瘤的小鼠模型中，用抗4-1BB單克隆抗體可增強NK細胞上活化標志物CD69的表達，以NK細胞依賴性方式增強對疾病控制[45]，但相同的方法在抗HIV治療中是否可行，還待進一步研究。受體調控的殺傷作用是NK細胞殺傷靶細胞的一個重要方式，深入研究并理解其作用機制將對如何提高活化性受體在NK細胞的表達，從而提升NK細胞的殺傷能力，延緩HIV感染病程進展具有積極意義。

4.2 NK細胞介導的ADCC NK細胞介導的ADCC作為NK細胞殺傷功能的一個重要組成部分，其作用越來越受到重視。在RV144疫苗試驗中，發現了ADCC對于控制HIV復制的保護性作用。研究表明，ADCC的效率與特定抗體特征相關，包括糖基化，可以通過對其修飾以增強NK細胞的募集和激活。值得注意的是，ADCC也會受到病毒逃逸的限制，病毒輔助蛋白Vpu可拮抗抗病毒因子tetherin，改變病毒聚集體的釋放并阻止ADCC介導的病毒識別。由此，抑制Vpu與tetherin相互作用的小分子抑制劑有望成為一種新的干預手段，且可用具有聚糖和亞基特征的抗體最大化ADCC，進一步增強抗病毒功能。同時，在對HIV感染的精英控制者與普通感染者的對比研究中發現，普通感染者的病毒輔助蛋白Nef可更為顯著地降低HIV-1感染細胞NKG2D配體的表達，且NKG2D配體表達水平與HIV-1感染細胞對ADCC的易感性相關。這表明NKG2D配體在 ADCC中起關鍵作用[46]。此外，HIV感染細胞因明顯下調MHC I類分子可被NK細胞識別并殺傷，但存在一部分HIV 株感染的細胞下調MHC I類分子水平較弱，導致NK細胞對其的直接殺傷能力與ADCC減弱，但用IFN-γ預刺激后，這部分HIV株感染的細胞仍對ADCC敏感，這表明IFN-γ預刺激可通過ADCC顯著增加NK細胞對HIV-1感染細胞的清除能力[47]。

4.3 NK細胞的分泌功能 除了NK細胞的殺傷功能，其分泌調節功能在控制HIV感染中的作用也不容忽視。NK細胞分泌的IFN-γ可促進其他免疫細胞如樹突細胞的成熟，成熟的樹突細胞又可分泌IL-2、IL-15、IL-18等促進NK細胞的增殖和分化。在HIV慢性感染中，這種相互作用受到極大損害，但在經過抗反轉錄病毒治療后，此種相互作用的功能可得到部分恢復[48]，此種功能的恢復是否與患者病情的控制相關仍待進一步研究。而在未經抗反轉錄病毒治療的個體中，對PD-1與IL-10共阻斷可恢復HIV特異性CD4+T細胞功能，進而通過IL-2和IL-12依賴途徑增強NK細胞的細胞因子分泌功能[49]。該研究提示了逆轉適應性免疫的耗竭可以改善固有免疫，并且免疫檢查點調節可作為HIV感染者的輔助治療手段。

4.4 NK細胞有望清除病毒儲存庫 病毒儲存庫的存在仍然是AIDS治療所面臨的一個巨大的挑戰。在淋巴結中，B細胞濾泡大部分缺乏包括NK細胞、CD8+T細胞在內的抗病毒殺傷細胞。因此，B細胞濾泡中的濾泡輔助性T細胞可以作為病毒的儲存庫。此外還發現巨噬細胞、B細胞中也可能存在病毒儲存庫[50]。最近的研究發現，在感染猴免疫缺陷病毒的非洲綠猴中，在趨化因子受體CXCR5或IL-15的存在下，NK細胞的數量在B細胞濾泡中明顯增多，進而可控制病毒在其中的復制[51]。該發現為清除HIV儲存庫指出了一個新的方向。是否可以在人體重現該模型，通過CXCR5的表達使NK細胞進入B濾泡細胞，并清除其中的病毒，值得更深入地思考和探討。

5 結 語

隨著對NK細胞研究的擴展與深入，也為AIDS的治療提供了許多新思路，NK細胞在控制HIV感染病程中扮演了重要角色。最近研究報道，一種廣譜中和抗體可以有效抑制患者血液中的HIV載量，這為預防、治療甚至治愈AIDS提供了可能性，而廣譜中和抗體的治療效能又依賴于NK細胞的ADCC；在趨化因子受體CXCR5或IL-15的存在下，NK細胞可進入B細胞濾泡，進而可控制病毒在其中的復制，有望清除病毒儲存庫；同時，無功能的耗竭型NK細胞可被逆轉為有殺傷功能的NK細胞，能有效提高機體控制病毒的能力，進而有效清除HIV。目前仍有許多問題亟待解決，如在HIV慢性感染中，NK細胞的亞群分布會發生顯著改變，而此種改變始于NK細胞發育的哪一階段，其受調控的機制等尚不明確；在腫瘤研究中得出的研究結果以及在小鼠模型或其他動物模型中得出的研究結果能否在人類身上重現，從而為治療HIV感染提供切實有效的方法等。治愈AIDS是一個巨大的挑戰，NK細胞在HIV感染中的重要作用值得更深入地研究與探索。