微針在經皮免疫中的應用進展

張杜娟，李麗萍，張蕊，郭瑞臣

(1濟南市婦幼保健院，濟南250001；2山東大學齊魯醫院)

疫苗接種是預防傳染病的有效手段，可分為病毒疫苗、DNA疫苗和細菌疫苗。隨著現代生物技術的發展，疫苗的劑型、接種方式等不斷改進，無針接種技術已成為研究熱點。經皮免疫(TCI)屬于無針接種，系局部應用疫苗抗原和(或)佐劑于皮膚表面，誘導機體產生系統性免疫反應。TCI彌補了傳統接種方式的不足，且不經胃腸道降解，作用更持久。微針是TCI中發展較迅速的一種，是由微細加工技術制成的具有不同形狀、結構和材料的微米級空心或實心針，刺入皮膚后，在角質層形成多個微米級通道，允許大分子藥物或微粒通過。微針細而尖，一般的穿刺深度僅在真皮乳頭層，未接觸到神經末梢，屬無痛給藥方式。根據內部結構的不同，微針可分為實心微針、包衣微針、可溶微針和空心微針。目前微針在TCI和疫苗接種領域的研究已取得較大進展?，F就微針在TCI中應用的最新研究進展綜述如下。

1 微針在病毒疫苗中的應用

病毒疫苗是最常見的疫苗，已有研究使用微針接種麻疹疫苗、脊髓灰質炎疫苗、流感疫苗等病毒疫苗[1～3]。目前，研究廣泛的病毒疫苗主要有減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗及病毒樣顆粒疫苗。

1.1 減毒病毒疫苗 減毒病毒疫苗是致病性減弱或消失的活病毒株，將其接種到身體內，會引發機體免疫反應，但不會引起疾病的發生。常見的減毒疫苗有麻疹疫苗、帶狀皰疹疫苗、黃病毒疫苗。但是，減毒疫苗是活病毒株，在實際接種中仍有一定的風險。對于嬰兒、孕婦、老人等免疫力低的人群，減毒疫苗可誘發嚴重疾??；部分減毒疫苗易恢復致病性，如口服脊髓灰質炎疫苗變異后易產生神經毒性，進入中樞神經系統引起癱瘓；另外，減毒疫苗在高于8 ℃環境中不穩定，需低溫運輸，運輸成本較高[4]。

研究表明，微針接種減毒疫苗既可產生較強的免疫反應，又能提高疫苗的穩定性。Dean等[5]使用微針將乙型腦炎病毒減毒疫苗接種于靈長類動物，結果顯示，相較皮下注射，微針接種后體內抗體滴度高，病毒血癥持續時間長，免疫反應更強。Edens等[6]使用可溶微針為恒河猴接種麻疹減毒疫苗，當接種相同劑量的疫苗時，微針接種和皮下注射可在恒河猴體內誘發相同的抗體水平；但穩定性試驗顯示，同樣在40 ℃條件下保存，液體疫苗7 d失活，凍干疫苗90 d失活，而微針疫苗可保存4個月。同時，有研究發現，疫苗接種時，皮內注射相較皮下注射產生的免疫反應強。Beals等[7]選取224例有水痘史的受試者，將不同劑量的減毒皰疹疫苗經皮下或皮內注射，結果皮內注射劑量為皮下注射的1/3時，卻產生比后者更強的免疫反應；當皮內注射劑量為皮下注射的1/10和1/27時，仍能產生與皮下注射相同程度的免疫反應。微針接種屬皮內注射，因此可產生較強的免疫反應。

1.2 滅活病毒疫苗 滅活病毒疫苗是指先對病毒進行培養，然后用化學或物理方法將其滅活而制成的疫苗。常見的滅活疫苗有流感疫苗、輪狀病毒疫苗、脊髓灰質炎疫苗(注射)、狂犬病疫苗等。滅活疫苗免疫原性低、接種劑量大、因其不會恢復致病性，較減毒疫苗安全。

最新研究顯示，使用微針接種滅活病毒疫苗，疫苗穩定性高，機體產生的免疫反應強。Chu等[8]發現，滅活流感病毒疫苗的普通液體制劑在非冷藏條件下1～2周即失活，而可溶微針疫苗在4、25、37、45 ℃條件下均可保存3個月。Kim等[9]研究表明，使用包衣微針接種三價流感疫苗可產生長期交叉保護作用，能預防季節性流感及新的流感病毒株感染。Schipper等[10]發現，用空心微針給大鼠分劑量接種脊髓灰質炎滅活疫苗，可產生較皮下或皮內單劑量接種更強的免疫反應。

1.3 亞單位疫苗 亞單位疫苗是通過化學分解或控制性的蛋白質水解方法，提取病毒的特殊蛋白質結構，篩選出的具有免疫活性的片段而制成的能誘發機體產生抗體的疫苗。與滅活疫苗相似，亞單位疫苗免疫原性低，安全性高，接種劑量大。常見的有流感病毒疫苗、寨卡病毒疫苗等。

微針接種亞單位疫苗也具有產生免疫反應強、疫苗穩定性高等優點。Kim等[11]用可溶微針接種重組寨卡病毒亞單位疫苗，4周后小鼠體內抗體水平保持較高水平，而且免疫小鼠孕育的幼鼠對病毒也有一定免疫性。Koutsonanos等[12]觀察了H1N1流感亞單位疫苗經包衣微針接種幼小鼠后引發的免疫反應，結果顯示，與肌注相比，微針接種產生的抗體滴度更高；同時，微針接種產生的濾泡B輔助性T細胞水平更高，可調節B細胞分化為記憶B細胞或效應B細胞。Mistilis等[13]發現，熱穩定亞單位流感疫苗在含HEPES、醋酸銨緩沖液及精氨酸等基質的制劑中最穩定，此制劑的微針產品可在25 ℃條件下保存6個月。另外，微針接種亞單位疫苗時，免疫佐劑的使用也能提高機體免疫反應。小鼠試驗顯示，微針接種流感亞單位疫苗時，使用咪喹莫特作為免疫佐劑可提高免疫反應[14]。

1.4 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒疫苗是含有某種病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒核酸，不能自主復制，能引起宿主的免疫反應，而不對宿主造成傷害，常見的有流感病毒疫苗。病毒樣顆粒疫苗比其他的病毒疫苗穩定，已成為疫苗研究的熱點。

病毒樣顆粒的微針疫苗具有穩定性高、機體免疫反應強的優點。Quan等[15]通過微針為近交雌性小鼠接種H1N1流感病毒病毒樣顆粒疫苗，結果顯示，海藻糖能提高病毒疫苗穩定性，機體可獲得超過1年的免疫力。另一研究顯示，含有流感病毒M2胞外區的病毒樣顆粒微針貼片中，疫苗室溫條件下可保存8周，同時對H1N1、H3N2和H5N1流感病毒具有交叉保護能力[16]。小鼠試驗顯示，微針接種此疫苗比肌內注射引起的免疫反應更強。免疫佐劑的使用也能提高機體的免疫性，以鼠傷寒沙門氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白為免疫佐劑，微針接種M2病毒顆粒，低劑量接種即可產生比肌內注射高劑量疫苗更好的免疫保護效果，與鼻腔免疫效果相當[17]。微針接種病毒樣顆粒疫苗已進入臨床試驗階段。美國傳染病研究中心(IDRI)用MicronJet600微針為健康受試者皮內接種H5N1病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒以苜蓿植物和吡喃葡萄糖脂質A為原料制成，在300例健康受試者中均未發現嚴重不良反應[18]。

2 微針在DNA疫苗中的應用

DNA疫苗又稱基因疫苗，是指將編碼某種蛋白質抗原的重組真核質粒表達載體直接注射到動物體內，使外源基因在體內表達并產生抗原，激活機體的免疫反應，從而誘導產生特異性的體液免疫和細胞免疫[19]。DNA疫苗可經肌肉或皮膚接種，轉染肌細胞或抗原呈遞細胞等。與傳統疫苗相比，DNA疫苗具有熱穩定性好、易于快速大規模生產和安全性高等優勢。目前，正在研發的乙肝DNA疫苗HEPLISAV-B正在Ⅲ期臨床試驗中，與傳統乙肝疫苗相比，安全性更高，免疫保護更強。

DNA疫苗的接種方式也是研究熱點，研究人員嘗試使用不同類型的微針接種DNA疫苗。Hu等[20]用實心微針接種黑色素瘤DNA疫苗，并考察了DNA疫苗的靶向性、小鼠體內抗黑色素瘤治療和預防免疫效果；結果顯示，腫瘤生長受到抑制，B16-移植瘤BALB/c小鼠存活時間延長。Kim等[21]用含pH敏感的聚電解質多層介質的包衣微針接種DNA疫苗，結果顯示，與傳統的皮下注射相比，微針接種能引起更強的免疫反應。Fernando等[22]研制成一種含有密集納米陣列的納米貼片，將流感核蛋白DNA疫苗包衣至納米貼片上，小鼠使用納米貼片經皮免疫后，與肌注相比，其體內抗體滴度更高，CD8+T細胞反應更強。Arya等[23]用可溶微針貼從比格犬內耳接種狂犬病DNA疫苗，與同劑量的疫苗肌注相比，產生的抗體滴度相當。Yang等[24]發現，PLGA-聚-L-谷氨酸/聚-γ-谷氨酸納米粒子與埃博拉病毒疫苗通過靜電作用可形成復合物，將復合物裝入可溶微針貼片中，接種至小鼠體內，能引發強烈的免疫反應。

微針接種DNA疫苗具有操作簡便、無痛、免疫反應強、易于大規模生產等優點。對于像流感、埃博拉和寨卡病毒等引起的感染性疾病，需要疫苗能快速大工業生產，而微針和DNA疫苗的結合是個可能的解決措施。

3 微針在細菌疫苗中的應用

目前正在研制的大多數疫苗針對病毒感染，但也有部分疫苗研究針對細菌感染。大量細菌寄生在人體中，其中多數是非致病菌，也有部分致病菌，能引起炭疽、破傷風、白喉、霍亂、傷寒熱和肺結核等疾病。目前，已用于人群的細菌性疫苗有卡介苗、百日咳疫苗、破傷風類毒素疫苗、霍亂弧菌疫苗等。隨著微針技術的發展，采用微針接種細菌疫苗的研究越來越多。

在發展中國家，產婦和新生兒破傷風是分娩過程中引起死亡的重要原因，接種破傷風類毒素能有效預防破傷風。Esser等[25]用可溶微針貼片為孕小鼠接種破傷風類毒素疫苗，與肌注相比，產生的免疫反應更強，孕小鼠存活率更高；母體用可溶微針貼片接種疫苗后，12周齡小鼠體內仍可檢測到破傷風抗體，當用破傷風毒素感染時，6周齡小鼠存活率100%。可見，用微針接種破傷風類毒素疫苗能有效預防破傷風，操作較簡便，具有較好的應用可能性。微針和新劑型的結合也能提高免疫效果。Siddhapura等[26]用實心微針和空心微針為小鼠接種破傷風類毒素殼聚糖納米粒，與接種傳統的破傷風疫苗相比，小鼠體內產生的IgG和IgG1滴度相當，而IgG2a滴度較高，因而產生免疫反應更強。新形式的微針給藥系統——點陣輔助粉末經皮給藥系統已用于接種卡介苗，體內試驗顯示，此種接種方式能產生與皮內注射相當的抗體滴度[27]。

微針自90年代出現，就成為經皮給藥的研究熱點，本文綜述了微針在病毒疫苗、DNA疫苗、細菌疫苗接種中的研究進展。使用微針接種疫苗有多種優勢：首先，微針接種簡單直接，無需專業訓練，普通人即可給藥；其次，微針細而短，接種疫苗時僅刺穿到真皮乳頭層，不觸及其中的神經和毛細血管，不帶來疼痛；再次，干包衣微針疫苗運輸不需要昂貴的冷鏈系統，降低了運輸成本；最后，微針接種節省劑量，微針直接將疫苗接種至富含抗原呈遞細胞的表皮層和真皮層，可產生比肌注更強烈的免疫反應。但是，目前尚無上市銷售的疫苗微針產品，發展最快的仍處于臨床試驗階段。相信隨著微針技術的不斷發展以及臨床研究的不斷深入，微針疫苗將逐步進入市場，成為未來TCI的新方式之一。