超聲微泡在腦惡性腫瘤治療中的應用進展

閆紫薇，趙云，張瑞濤

(1三峽大學醫學院，湖北宜昌443000；2三峽大學第一人民醫院)

血腦屏障是由各種緊密連接蛋白連接的內皮細胞、星形膠質細胞的足突、周細胞及基底膜等構成，是神經血管單位的選擇性屏障。血腦屏障僅允許小分子的親脂性藥物通過，阻止幾乎所有大分子和99%的目前可用的小分子(>400 Da)藥物進入大腦[1，2]，因此限制了藥物對腦惡性腫瘤的治療。克服血腦屏障的辦法包括：打開顱骨直接將藥物注射到靶區；通過鞘內注射藥物到腦脊液，然后擴散到腦實質；改變藥物結構使其能夠被動擴散通過血腦屏障；通過化學方法開放血腦屏障等。但侵入性操作存在出血、感染的風險，化學方法靶向性較差或費用昂貴。微泡是一種聲學造影劑，低頻聚焦超聲聯合微泡已經被證實能夠可逆性開放血腦屏障，有助于藥物透過血腦屏障進入腦實質，同時微泡還可以作為藥物載體聯合低頻聚焦超聲靶向遞送藥物至腦內。本文主要闡述超聲微泡開放血腦屏障的機制，闡述其介導藥物治療腦惡性腫瘤的作用及局限性。

1 超聲微泡開放血腦屏障的機制

1.1 機械效應 低頻聚焦超聲聯合微泡能夠無創性、靶向性、可逆性開放血腦屏障，有利于促進藥物在腦內釋放。如果超聲照射的聲壓比較低，微泡就會發生穩定空化。穩定空化產生的剪切應力和微流(微泡振蕩產生微泡周圍的流體流，即源于微泡的放射力)，造成局部沖擊波。這些機械效應導致血腦屏障緊密連接的完整性下降[3，4]，內皮細胞腔面細胞膜變形或通透性增加[4]。超聲輻照使微泡在毛細血管中快速膨脹和收縮，較大的微泡膨脹時導致血管壁機械拉伸，從而打開內皮細胞的緊密連接，導致血腦屏障的功能破壞。鄧金木等[5]研究表明，聚焦超聲聯合微泡開放血腦屏障的程度要大于聚焦超聲和微泡單獨使用之和。

1.2 應激反應 低頻超聲穿透性強，可在不打開顱骨的情況下促使血腦屏障開放。當對生物組織進行超聲照射時，可以誘導進入組織的微泡產生非線性振蕩。微泡非線性振蕩也可能減少局部血流量，使局部暫時性缺血，導致缺氧性應激反應，從而破壞并開放血腦屏障[6]。

1.3 促進內吞 超聲微泡的穩態空化會對血管壁產生機械應力和剪切應力，影響內皮細胞中的機械敏感蛋白，將細胞外的機械信號轉化成細胞內的生物化學信號[7]。caveolae是位于細胞質膜表面的囊狀結構，其主要功能是介導跨細胞膜的內吞轉運，其中最重要的標志性蛋白分子是caveolin-1，血腦屏障的開放程度與caveolin-1的表達水平一致。研究表明，聚焦超聲聯合微泡能夠有效增加中樞神經系統微血管內皮細胞上caveolae的數量及caveolin-1蛋白表達水平，提示聚焦超聲聯合微泡開放血腦屏障時，caveolae介導的內吞作用發揮了非常重要的作用[5]。

1.4 抑制外排 血腦屏障既是物理屏障又是功能屏障。聚焦超聲聯合微泡可以影響緊密連接，限制被動的細胞旁途徑以及刺激囊泡跨細胞轉運[8]，具有暫時破壞血腦屏障的能力。P-糖蛋白是在血腦屏障內皮細胞膜上表達的最主要的多藥耐藥蛋白，其底物包括多柔比星(DOX)、柔紅霉素、長春堿、長春新堿、依托泊苷等抗癌藥物。P-糖蛋白可主動泵出大部分藥物，減少藥物在腦組織中的滯留和累積。此外，P-糖蛋白在腫瘤中的存在有助于癌細胞對化療藥物產生耐藥性并降低療效。研究發現，超聲可以暫時抑制P-糖蛋白的表達。當聲壓幅度為0.55 MPa時，血腦屏障被破壞，P-糖蛋白被抑制達48 h，恢復時間為72 h；當聲壓幅度為0.81 MPa時，抑制效應可以持續72 h或更長。這些發現支持微泡聯合聚焦超聲通過抑制藥物外排破壞血腦屏障功能，導致藥物存在于腦實質中的時間增加，從而增加藥物的功效[9]。

1.5 影響轉運途經 研究表明，血腦屏障通透性增大的基礎是caveolae介導的claudin-5表達水平的改變[10]。claudin-5在大腦所有血管內皮細胞上均有較高的表達，是緊密連接的關鍵性蛋白。聚焦超聲聯合微泡開放血腦屏障時，claudin-5表達水平顯著下降，即緊密連接復合體減少，說明claudin-5介導的細胞旁途徑在聚焦超聲聯合微泡打開血腦屏障中具有重要作用[5]。另有研究表明，claudin-5表達的變化要晚于caveolin-1，提示后者在血腦屏障開放早期具有重要意義[11]。由此可見，聚焦超聲聯合微泡所產生的機械力可能影響跨細胞途徑和細胞旁途徑，從而導致血腦屏障開放。

2 超聲微泡的載藥機制

2.1 作為載體傳送藥物 利用超聲微泡包裹藥物，可以作為有效載體，攜帶治療藥物轉移運到靶位點或目標組織，在轉運過程中微泡可以保護藥物有效載荷不被酶破壞，從而實現高精度的遞送治療藥物[12]。超聲微泡攜帶藥物或基因的方式有很多種，如：將基因或藥物直接黏附于微泡殼膜表面，使用帶正電荷脂質層殼微泡，靜電結合帶負電荷的核酸，例如siRNA、miRNA、mRNA和質粒DNA；將基因或藥物包裹入微泡內部，疏水性藥物可以封裝在穩定微泡的脂質或聚合物殼內；將基因或藥物包裹在雙分子層微泡內外層之間。超聲脈沖引起的極端振蕩導致微泡破裂，藥物被釋放。

2.2 增加藥物吸收 微泡在腫瘤微血管中震蕩可以增加內皮細胞的通透性，增強藥物外滲，增加細胞對藥物的吸收，從而導致腫瘤血管破壞及營養物質供應減少[12]。穩態和瞬態空化現象在增加生物屏障(包括血管內皮和細胞質膜)的瞬時通透性中都會發揮作用。通過影響跨細胞途經、細胞旁路途經及增加細胞膜孔隙的方式導致生物屏障的通透性增加，有利于細胞攝取及外滲治療性藥物分子[13～15]。這些載有藥物或基因的微泡在體內的循環可以使用超聲對比成像進行追蹤，隨后使用超聲脈沖破壞微泡，使有效載荷在靶組織或靶器官釋放[16]。

3 超聲微泡開放血腦屏障在治療腦惡性腫瘤中的應用

3.1 超聲微泡在化療藥物治療腦惡性腫瘤中的作用 卡莫司汀是治療腦膠質瘤的常用化療藥物。載有卡莫司汀的脂質微泡聯合聚焦超聲實現了卡莫司汀在腦內靶向釋放，卡莫司汀微泡使卡莫司汀的半衰期延長5倍，并且增強了藥物向大腦的遞送效率。研究表明，卡莫司汀微泡與單獨使用卡莫司汀的對照組相比對，肝臟的毒性更小，對腫瘤的治療效果更好，實驗動物的中位生存時間及最大存活時間顯著延長。

血管內皮生長因子受體2(VEGF-R2)在膠質瘤內皮細胞中過度表達，其主要功能是介導細胞增殖和遷移，并導致腫瘤區域的血管過度生成。研究者設計了一種結合VEGF-R2-配體和卡莫司汀的微泡，命名為VEGF-BCNU-MBs，靶向遞送藥物至過度表達VEGF-R2受體的腫瘤血管系統，免疫熒光染色證實腫瘤區域藥物濃度的累積增高。VEGF-BCNU-MBs與載卡莫司汀微泡相比，肝臟毒性更小，對腫瘤的抑制作用更強[17]。

紫杉醇是一種廣泛應用于顱外癌癥的抗腫瘤藥物，脂質體能夠包封疏水性紫杉醇，從而減少藥物的毒性，同時增強其治療效果，紫杉醇脂質體(PTX-LIPO)是一種有前途的抗腫瘤制劑，但血腦屏障及血液腫瘤屏障(BTB)的存在使得脂質體藥物難以穿過，導致其在腦惡性腫瘤的應用受到限制。Shen等[18]研究表明，聚焦超聲聯合微泡可以提高PTX-LIPO穿透血腦屏障及血液腫瘤屏障的遞送效率。與未經聚焦超聲治療組相比，超聲微泡組中膠質母細胞瘤中累積的藥物濃度增加了2倍，且腫瘤裸鼠的中等存活時間延長了20.8%。

DOX廣泛用于顱外腫瘤的治療，但對顱內惡性腫瘤無效，其原因也是由于DOX的脂質體不易穿越完整的血腦屏障。Treat等[19]研究表明，聚焦超聲聯合微泡破壞了完整的血腦屏障，可以顯著增加DOX脂質體治療腦惡性腫瘤效果。

目前中樞神經系統白血病(白血病細胞浸潤腦膜或腦實質)常用的治療方法有放療、全身化療以及鞘內注藥化療，存在腦組織損傷、出血、感染、腦脊液漏、血栓等風險。阿糖胞苷是治療急性白血病的常用化療藥物，利用低頻聚焦超聲聯合微泡能夠顯著增加腦組織阿糖胞苷濃度[20]，避免大劑量靜脈給藥可能帶來的全身不良反應。

3.2 超聲微泡在生物免疫治療腦惡性腫瘤中的應用 HER2靶向抗體(即曲妥珠單抗和培妥珠單抗)可以延長顱外轉移HER2陽性乳腺癌患者的存活率，但是腦轉移瘤對這些藥物的反應很差。Kobus等[21]研究表明，使用超聲微泡聯合HER2靶向抗體可以抑制乳腺癌腦轉移的生長，而且他們的研究還發現，對HER2單抗不敏感的腦惡性腫瘤患者也可能受益于聚焦超聲介導的血腦屏障破壞。

使用低密度脂蛋白(LDL)納米顆粒結合超聲微泡開放血腦屏障運送二十二碳六烯酸(DHA)到大腦，可以用于急性腦損傷的區域治療或靶向遞送藥物治療腦惡性腫瘤。使用超聲微泡聯合LDL-DHA納米顆粒，DHA不僅進入大腦，而且能攝入腦細胞，使腦內的DHA水平增加2倍。

抗腫瘤自殺基因療法是將無毒前藥轉化為細胞毒性藥物的基因導入腫瘤細胞，而達到抑制或殺傷腫瘤組織的目的，是治療腦惡性腫瘤的一種新療法。將單純皰疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-tk)基因轉移到腫瘤細胞中，可增強細胞對抗病毒藥物的敏感性。HSV1-tk可以將更昔洛韋(GCV)磷酸化為單磷酸，然后通過細胞激酶磷轉化為二磷酸鹽和三磷酸鹽，GCV的二磷酸鹽和三磷酸鹽對處于增殖期的哺乳動物細胞有很強的毒性作用，從而殺傷處于活躍增殖狀態的腫瘤細胞。Yang等[22]報道，超聲微泡聯合GCV與單獨GCV治療相比，能更顯著地抑制帶有熒光素酶/綠色熒光蛋白/HSV1-tk三重報道基因的原位F98神經膠質瘤的生長。Yang等[23]研究顯示，聚焦超聲誘導的血腦屏障破壞能夠將高劑量的化療藥物集中到腦惡性腫瘤中，并增強其抗腫瘤作用。

白細胞介素12(IL-12)不僅是免疫系統的重要成分，還是一種潛在的強效抗腫瘤細胞因子。Pin等[24]研究發現，IL-12腹腔給藥聯合超聲微泡打開血腦屏障組同對照組相比，其腦惡性腫瘤中的IL-12增加更顯著，CTL增加和CTL/Treg比例增加，更有助于抑制腫瘤發展及延長動物的存活時間。說明聚焦超聲開放血腦屏障可以增強免疫調節劑遞送至大腦，提高了腦惡性腫瘤治療中的抗癌免疫應答。

3.3 超聲微泡在放療治療腦惡性腫瘤中的作用 硼中子俘獲治療是臨床上治療神經膠質瘤的生物靶向放射治療方法，該療法是將含硼的藥物施用于癌細胞然后用熱中子照射，使硼原子與熱中子發生俘獲反應，產生的射線會破壞癌細胞的遺傳物質并使其死亡。超聲聯合微泡打開血腦屏障的方式使硼苯丙氨酸的腦內吸收增加，提高了硼中子俘獲治療神經膠質瘤的效果。

4 超聲微泡應用的局限性

4.1 超聲微泡可能造成腦損傷 超聲與微泡相互作用時不僅釋放藥物，還可能誘導血腦屏障的組織學損傷。低強度聚焦超聲聯合微泡打開血腦屏障時，機械聲學空化效應會導致熱休克蛋白、IL-1、IL-18、TNF-α升高，提示可能存在無菌性炎癥反應。但也有研究提出了相反觀點，認為聚焦超聲聯合微泡可以安全可控地對恒河猴進行腦內靶向給藥，在0.20～0.30 MPa的聲壓強度下，可以破壞血腦屏障并且沒有腦組織損傷，沒有行為改變及視力損傷，由此說明特定參數的聚焦超聲聯合微泡對于非人類靈長類動物是安全的[25,26]。

有人提出，在聚焦超聲誘導的血腦屏障破壞模型中，可通過低強度脈沖超聲來減小腦損傷，有效調節聚焦超聲誘導的血腦屏障破壞的通透性和時間窗口，使藥物可以精準控釋到大腦中。在聚焦超聲聯合微泡介導血腦屏障破壞中，Su等[27]最先研究了使用低強度脈沖超聲來調節血腦屏障持續時間并減少腦水腫，結果表明低強度脈沖超聲治療能有效減輕大鼠腦損傷、神經元損傷和細胞凋亡。因此，選擇合適的治療參數能有效保障治療的安全性。

4.2 超聲微泡可能導致的其他并發癥 Aryal等[28]在使用DOX脂質體聯合超聲微泡治療膠質瘤大鼠時發生的一些不良反應，包括廣泛的瘤內出血、腫瘤周圍腦組織損傷、腫瘤位點組織缺失、活動受限、皮膚毒性等。瘤內出血可能與腫瘤的血管壁壞死有關，皮膚毒性可能與DOX已知的不良反應有關。由于目前的研究樣本量有限，未來還需要研究者做更多的工作來研究相關治療的有效性的不良反應的發生率。

5 小結與展望

血腦屏障限制了腦惡性腫瘤的藥物治療，隨著分子影像技術學的發展，超聲微泡為腦惡性腫瘤的治療帶來了新的希望。超聲微泡利用空化效應能可逆性地開放血腦屏障，促進藥物進入腦內，且微泡還能作為藥物載體，保護藥物在轉運途中不被酶破壞。研究者將超聲微泡與化療藥物、生物免疫治療、放療等相結合，提供了新的治療方法。但現在的研究大多數還停留在臨床前的研究，要將其應用于臨床還需要解決一些問題：首先，超聲聯合微泡開放血腦屏障的安全參數需要進一步明確，需要更多的試驗來提高其安全性；其次，超聲微泡用于開放血腦屏障治療腦惡性腫瘤的相關并發癥及不良反應還需要進一步明確，并提出解決的方法。