NMDA受體磷酸化調控及其與神經系統疾病關系的研究進展

劉佩強，覃丹雪，陳慧英，黃喜，葉文華，蘇紀平

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體是一種離子型谷氨酸受體，它在中樞神經系統興奮性神經傳遞中發揮重要作用。NMDA受體的磷酸化調控是突觸定位和功能調節的重要分子機制，其調節失調與缺血缺氧損傷、疼痛傳導及老年性癡呆等神經退行性疾病等都有密切關系。本文總結了NMDA受體磷酸化研究的最新進展，并綜述NMDA受體磷酸化與神經系統疾病的關系。

1 NMDA受體及磷酸化調控

突觸傳遞是神經系統處理和儲存信息能力的核心，哺乳動物大腦中的興奮性突觸傳遞主要由谷氨酸調節，而NMDA受體是主要的谷氨酸受體，其介導的Ca2+內流是突觸可塑性的觸發器，激活信號轉導的級聯反應，從而調節長時程增強和神經細胞變性。NMDA受體是由7種不同的亞單位NR1、NR2A～D和NR3A～B形成的四聚體，大多數NMDA受體由2個NR1和2個NR2亞單位裝配而成，裝配完成后的NMDA受體能選擇性定位于興奮性突觸的突觸后膜，調節突觸的形成、修飾和刪除等各種不同的功能。NMDA受體包含胞外配體結合域，胞外N端結構域，由3個氨基酸疏水性螺旋M1、M3、M4組成跨膜區域，胞內凹陷回路，胞內C末端[1]。

NMDA受體亞單位的C末端可調控受體裝配運輸和表面表達，基因敲除NR2A中CTDs表達的小鼠可以存活到成年期，但它們具有突觸可塑性缺陷，而那些敲除NR2B中CTDs的小鼠則會死亡。受體調控失調可能是由于失去了磷酸化位點，細胞內蛋白的相互作用缺陷，或結構需求的變化導致的[2]。另有研究提示，NR1和NR2亞單位可以通過細胞內C末端磷酸化作用調控NMDA受體的細胞信號轉導、受體成簇以及突觸定位，調節受體與多種胞內蛋白的相互作用[3]，進一步提示C末端是激酶/磷酸酶系統進行修飾特定的分子靶點。研究表明，NMDA受體介導的信號傳導依賴于該受體磷酸化狀態和選擇性剪接，以及異聚體通道的裝配。通過各種蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性的精細調節而改變NMDA受體磷酸化狀態與水平，從而調控受體的生化特性，包括生物合成、信號傳遞和亞基組裝、亞細胞分布，以及受體與各種突觸蛋白的相互作用，最終影響興奮性突觸的效能和強度，改變突觸可塑性，調節突觸的通道功能和受體定位，迅速和可逆地改變細胞內蛋白的功能，對刺激信號的反應高度精確[4]。

目前發現與NMDA受體相關的蛋白激酶主要分為兩大類：一類是絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、鈣調蛋白激酶(CaMKⅡ)、酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、細胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)、蛋白激酶B(PKB/Akt)；一類是酪氨酸激酶(ErbB)，包括Src、Fyn。

1.1 絲氨酸/蘇氨酸磷酸化 在NMDA受體亞單位中的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點是眾多激酶的調節載體，這些蛋白激酶位點目前在NR1、NR2上被發現。研究發現，特定亞單位位點的磷酸化狀態可調節通道活動，NR1的C末端也可以細胞特異性和活動依賴性的調節NR1/NR3A電流的水平和藥物敏感性。利用特定的NR1磷酸化位點抗體發現，PKC、PKA都可使NR1的C末端磷酸化，NR1亞單位S890、S896位點被PKC磷酸化，S897位點則是被PKA磷酸化，而且PKC和PKA在大腦中有不同調節作用[5]。另有研究發現，NR1在小腦顆粒細胞中被兩種不同的PKC亞型磷酸化，S890優先被PKCγ磷酸化，而S896則是被PKCα磷酸化。因此S890和S896磷酸化有著不同的調控，并在時空分布和特定PKC亞型激活依賴性的受體調控中起著獨特的作用[6]。

NR2A有兩個PKA磷酸化位點S900和S929，替換NR2A的S900、S929位點基因后測量受體單通道功能，出現明顯抗磷酸化表現，這兩個位點的去磷酸化可能會導致受體更快地失去活性、更頻繁地脫敏[7]。NR2A上存在3個PKC位點，S1291和S1312位點磷酸化可增強NR2A受體電流；S1416磷酸化可降低CaMKⅡ與NR2A結合的親和力，使CaMKⅡ與PKC兩種信號通路交叉對話[8]。另外，研究發現Cdk5可誘導NR2A的S1232磷酸化；抑制Cdk5活性可以防止在小鼠的CA1錐體細胞中誘導LTP[9]。

NR2B有兩個PKC磷酸化位點，NR2B的S1303、S1323位點被PKC磷酸化，從而導致體外轉染表達形成的功能性NMDA受體的電流變大[10]。其中，S1303也是CaMKⅡ和凋亡相關蛋白激酶1(DAPK1)磷酸化的位點。S1303為這些激酶調節NR2B的共同靶點，CK2介導S1480位點的磷酸化，導致NR2B和突觸后密度蛋白95(PSD-95)的相互作用減弱，引起NR2B內化，調節興奮性突觸功能和可塑性。CaMKⅡ可耦合NR2B與CK2形成三分子復合體，通過CaMKⅡ增強CK2介導的NR2B的S1480磷酸化[11]。最近研究發現，NR2B的S1116位點被Cdk5磷酸化，而干擾Cdk5和NR2B相互作用的多肽能減少S1116位點的磷酸化，造成NR2B表面表達增多[12]。NR2B中S1166位點亦被發現是PKA磷酸化的新靶點，該位點去磷酸化會阻斷PKA依賴的NMDA受體介導的Ca2+滲透、突觸電流、Ca2+在樹突棘上的增加[13]。

1.2 酪氨酸磷酸化 蛋白酪氨酸磷酸化調控是蛋白質翻譯后修飾的一類快速且重要的功能性調控方式。大量證據表明，NMDA受體的NR2亞單位酪氨酸磷酸化主要是由Src家族激酶介導的[14～17]。基因定點誘變發現，HEK細胞Src/Fyn所致的酪氨酸磷酸化中，NR2A的Y1292、Y1325和Y1387是重要的磷酸化位點，可增強NMDA受體電流。另外，NR2A的Y842去磷酸化可能調節內化網格蛋白AP-2和NMDA受體的相互作用，參與形成內吞性內涵蛋白包被小泡[14]。

NR2B包含四個酪氨酸磷酸化位點，即Y1070、Y1252、Y1336、Y1472。其中Y1472位點磷酸化的主要細胞生物學功能已被研究得比較透徹，Src或Fyn使該位點磷酸化從而阻斷NR2B與內化網格蛋白AP-2 的結合，導致因NR2B的內化減少所致的細胞膜表面表達增多[15]。Fyn可磷酸化Y1336位點，抑制該位點的磷酸化則可減弱鈣剪切酶對NR2B胞內C末端的剪切，提示了Y1336磷酸化介導的谷氨酸興奮性毒性中的功能[16]。另外，Fyn過度表達增強了突觸膜上NR2B的Y1472和Y1252磷酸化，可通過維持NMDA受體的突觸表達和增加NMDA受體對谷氨酸的反應來促進興奮性細胞死亡[17]。近期發現，Y1070位點被Src家族激酶磷酸化，將Y1070位點由酪氨酸(Y)突變為苯丙氨酸(F)后，全細胞記錄電流和生物素化及表面染色的方法，都表明NR2B的表面表達減少[18]。

2 NMDA受體磷酸化調控與神經系統疾病的關系

2.1 精神分裂癥 精神分裂癥是一種衰弱性精神疾病，NMDA受體功能失調是精神分裂癥的關鍵致病機制。NMDA受體拮抗劑可誘發精神分裂癥的認知障礙和消極癥狀，利用其誘導的精神分裂癥動物模型被認為是目前最理想的精神分裂癥模型。研究發現，精神分裂癥患者NR1亞單位的表達失調，其中NR1亞單位S897的磷酸化作用顯著降低，小鼠體內NR1的S897被丙氨酸(A)取代后，這種突變在NMDA受體突觸結合和其介導的突觸傳遞中導致嚴重的損害，從而產生精神疾病相關的社交互動和感覺運動控制方面的行為缺陷[19]。另有研究發現，神經調節蛋白1(NRG1)、ErbB是精神分裂癥的易感因子，NRG1-ErbB4信號通常激活Fyn并促進NR2B Y1472的磷酸化，從而增強NMDA受體的功能。在損傷新生大鼠海馬造成精神分裂癥樣行為缺失的實驗中，NRG1和ErbB激酶抑制劑可抑制神經元中NRG1誘導的NR2B的磷酸化，改善精神分裂癥的行為缺失。NRG1-ErbB4信號系統既能抑制NMDA受體功能導致谷氨酸功能低下，又可影響神經通路傳遞和突觸可塑性，干擾神經元遷移、影響軸突髓鞘化等環節，參與了精神分裂癥的發病過程[20]。最近研究發現，孕酮硫酸鹽是中樞神經系統內的內源性神經甾類，是一種積極的NMDA受體變構調節劑，可提高小鼠紋狀體PKB和糖原合成激酶3β(GSK3β)水平，長期使用可提高海馬體NR1亞單位的磷酸化水平，從而通過NMDA受體介導的Akt-GSK3β信號傳導途徑來改善大鼠的躁動、認知障礙等表現[21]。TrkB激動劑7,8-DHF能顯著提高TrkB激活的Y515和Y816位點磷酸化，增加TrkB下游信號級聯的磷酸化水平，包括ERK1/2、CaMKⅡ、NMDA受體和AMPA受體，促進海馬突觸可塑性，進而恢復工作學習能力，逆轉精神分裂癥的認知缺陷[22]。另有研究發現，5-HT2A受體拮抗劑ITI-007能顯著增加小鼠伏隔核中NR2B的磷酸化作用，這一效應能夠促進NMDA受體神經信號傳遞，其原因可能是繼發于激活多巴胺受體D1。

2.2 阿爾茨海默病(AD) AD是一種與記憶障礙有關的神經退行性疾病，其特點包括tau蛋白過度磷酸化、β-淀粉樣蛋白(Aβ)積累和淀粉樣斑塊的形成，這些都與突觸喪失和認知下降相關?？扇苄訟β低聚物是樹突狀細胞病理主要神經毒性物質，可與細胞表面朊蛋白結合，導致突觸中異常的NMDA受體激活。朊蛋白在突觸后密集區與Fyn相互作用，并與Aβ形成復合物，激活的Fyn引起NR2B亞單位的酪氨酸磷酸化。興奮性毒性可以導致樹突棘突處突觸可塑性損害和結構功能喪失，最終導致神經元變性壞死。Fyn也可導致tau蛋白過度磷酸化，因而Fyn是AD病理治療的一個潛在靶點。Fyn激酶阻斷劑馬賽替尼和塞卡替尼已被證明用于治療AD模型小鼠有效，目前處于臨床試驗中。

2.3 創傷性腦損傷(TBI) TBI的存活者常伴有抑郁、認知和運動障礙，其病因多半是大腦重塑的谷氨酸能神經傳遞異常紊亂導致細胞去極化，引起Na+、Cl-、H2O向細胞內流動，導致急性滲透性細胞腫脹，腦水腫形成，興奮毒性病因排除后可部分恢復正常。動物實驗顯示，阻斷NMDA受體介導的谷氨酸毒性作用可以減輕TBI所致的神經功能缺損。其機制之一可能是通過抑制SFKs使NR2B的Y1472去磷酸化，增加NMDA受體的內化作用[23]。TBI導致Src抑制性位點Y527的磷酸化明顯下調，而它的活化位點Y416也相應降低，表明在TBI發病后SFKs被顯著抑制。Src激酶的磷酸化位點的減少導致突觸表面NR2表達部分失衡，NMDA受體的內化增多和進一步降解。研究發現，ErbB抑制劑PP2可抑制NR2B磷酸化，并使NR2B亞單位表達恢復到正常水平，因此其可能作為TBI神經外科手術的術前治療[24]。

2.4 神經病理性疼痛 神經病理性疼痛的生理和病理過程包括神經系統敏感化、內臟疼痛、細胞凋亡及壞死等，與NMDA受體密切相關，其表達亢進能導致脊髓背角神經元痛覺異常敏感性，并使傷害性感覺神經元發生鈣超載；同時可誘發細胞內鈣敏感性的信號級聯反應，使NMDA受體亞基的不同磷酸化位點發生磷酸化，促使線粒體功能紊亂，其釋放的凋亡因子可使神經元變性和死亡。神經病理性疼痛潛在的機制涉及PKA、Fyn。在疼痛大鼠模型的脊髓背角神經元內，PKA可使NR1磷酸化增多，抑制NR1的磷酸化被證明可用于治療神經病理性疼痛。利用注射弗氏佐劑制作的大鼠疼痛模型發現，NR2A和NR2D先天缺陷大鼠的突觸后脊髓背角神經元上NR2B亞單位Y1472酪氨酸磷酸化增加[25]。研究發現，Src相關基因敲除的小鼠表現出中樞反應性和機械性神經痛的敏感行為減弱，因此Src功能被認為是痛覺超敏反應的關鍵。Src抑制劑與沙阿替尼聯用能阻斷Src與NMDA受體的結合，阻斷了NMDA受體的磷酸化，從而降低疼痛的敏感性[26]。除SFKs外，NMDA受體磷酸化水平也由蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTPs)決定。PTPs抑制劑能顯著抑制Src活性，減少Src介導的NR2B磷酸化，減少NR2B的突觸累積，最終改善病理性疼痛[27]。阿片類藥物減輕炎癥性疼痛的能力受NMDA受體的負調控，嗎啡可增強PKC介導的NR1的C1段的磷酸化，并增強CaMKⅡ的作用，這種途徑與嗎啡的耐受性有關。PKC的抑制劑可恢復阿片受體與NR1的聯系，增強嗎啡的止痛效果。腎上腺素能α2受體激動劑右旋美托咪啶可調節脊髓背側角神經元上NMDA受體的表達、膜受體轉運和功能，以及PKC和CaMKⅡ水平，從而有效改善痛覺過敏[28]。

3 展望

迄今為止，NMDA受體上已被鑒定出具有功能意義的有14個絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點、9個酪氨酸磷酸化位點，更明確了這些磷酸化位點及其激酶對NMDA受體的功能調控。既然這么多磷酸化位點及其激酶都參與了對NMDA受體功能的調控，那么在神經系統疾病的發生與發展中，各磷酸化位點的變化情況、各蛋白激酶相互調控的功能等問題值得我們進一步探討，同時未來可能將各種神經系統疾病的發病機理或進展與NMDA受體磷酸化研究結合，以期進一步揭示深層發病機制，發現潛在的干預靶點。