丹參酮ⅡA對HCY誘導增殖血管平滑肌細胞ERS相關基因免疫球蛋白重鏈結合蛋白表達的影響

韓芬

【摘要】 目的 探究丹參酮ⅡA對同型半胱氨酸（HCY）誘導增殖血管平滑肌細胞（VSMC）內質網應激（ERS）相關基因免疫球蛋白重鏈結合蛋白（Bip）表達的影響。方法 通過HCY誘導構建兔VSMC增殖模型， 給予瑞舒伐他汀或不同濃度的丹參酮ⅡA進行培養， 采用實時熒光定量PCR測定實驗兔Bip mRNA基因表達。結果 模型組Bip mRNA表達（3.27±0.30）高于空白對照組（0.13±0.35）， 差異具有統計學意義（P<0.05）;丹參酮ⅡA組0.5 mg/L劑量的Bip mRNA表達（4.53±0.60）、1.0 mg/L劑量的Bip mRNA表達（12.71±0.27）、瑞舒伐他汀組Bip mRNA表達（8.80±0.21）均高于模型組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 丹參酮ⅡA對HCY誘導增殖VSMC ERS相關基因Bip表達具有明顯作用。

【關鍵詞】 丹參酮ⅡA;血管平滑肌細胞;同型半胱氨酸;免疫球蛋白重鏈結合蛋白

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.07.116

目前臨床尚未闡述動脈粥樣硬化（AS）的發生機制， 但普遍認為與血管內皮損傷、血小板粘附、纖維組織增生、平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）等因素相關， 其中動脈粥樣硬化病變形成的關鍵環節為VSMC遷移、增殖、攝取低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）轉變成泡沫細胞[1， 2]。有效干預VSMC遷移、增殖對動脈粥樣硬化程度的降低具有重要的臨床意義。本文對丹參酮ⅡA對VSMC內質網應激（endoplasmicreticulumstress， ERS） 相關基因免疫球蛋白重鏈結合蛋白（immunoglobulin heavy chains binding protein， Bip） 表達的影響進行分析， 旨在探究丹參酮ⅡA對動脈粥樣硬化起到的藥理作用， 為丹參酮ⅡA治療心血管疾病的有效性提供依據， 現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 細胞：兔主動脈VSMC（中國協和醫科大學基礎醫學院細胞培養中心）。藥品：丹參酮ⅡA對照品、瑞舒伐他汀、HCY分別來自（中國藥品生物制品鑒定所， 批號200619 ）、（阿斯利康制藥有限公司， 批號ER322）、（Sigma公司， 批號C-7352）。純度均在98%及以上。儀器：7500 Fast Dx 實時定量PCR儀、Tgradient PCR 擴增儀、IX71-F22FL /PH型倒置相差熒光顯微鏡。試劑：實時定量試劑盒與總RNA 提取試劑（日本Takara公司） 。

1. 2 方法 首先制備細胞懸液， 即丹參酮ⅡA組、空白對照組、模型組、瑞舒伐他汀組， 以1×108/L密度對以上四組細胞進行稀釋， 并接種在96孔培養板實施培養， 24 h 后分別對其中三組（丹參酮ⅡA組、瑞舒伐他汀組、模型組）加入1×10-4mol/L的HCY， 空白對照組僅加入等體積培養液。24 h后， 瑞舒伐他汀組加入終濃度10 μmol/L瑞舒伐他汀， 同時丹參酮ⅡA組分別加入終質量濃度0.5、1.0 mg/L丹參酮ⅡA， 培養48 h。引物設計：β-actin， 上游、下游分別為5'-CTACAATGAGCTGGTGTGG-3'、5'-AGCTCTTCTTCAGGGAGGA-3';Bip， 上游、下游分別為 5-TCT AGGTGAACGACCCCTAAC-3、5-GTTCTCTCAATTTTCTCCCAAC-3。從以上述每組提取細胞總RNA， 以逆轉錄方式合成cDNA。PCR反應體系、SYBR Green I Mixture分別為10、5 μl， 上下游引物均為0.25 μl， 模板cDNA、ddH2O、Rox分別為1、3.3、0.2 mol/L。反應條件如下： 95℃預變性10 min、95℃變性30 s、58℃退火與72℃延伸均為40 s， 總共45個循環， 各個樣本RNA含量均依照各自β-actin含量進行標準化， 利用2-△△CT 法對Bip基因相對表達予以分析。

1. 3 觀察指標 分析丹參酮ⅡA對VSMC ERS相關基因Bip表達的影響。

1. 4 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數± 標準差 （ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

模型組Bip mRNA表達（3.27±0.30）高于空白對照組（0.13±0.35）， 差異具有統計學意義（P<0.05）;丹參酮ⅡA組0.5 mg/L劑量的Bip mRNA表達（4.53±0.60）、1.0 mg/L劑量的Bip mRNA表達（12.71±0.27）、瑞舒伐他汀組Bip mRNA表達（8.80±0.21）均高于模型組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

隨著大量臨床實踐研究的深入， 認定動脈粥樣硬化形成的關鍵環節為血管內皮細胞損傷、血管壁炎癥反應、VSMC增生與遷移等， 同時已證實血管壁組成細胞、細胞外基質、血液成分間的相互作用是導致動脈粥樣硬化病變形成、VSMC增殖的關鍵環節[3-5]。加強保護內皮細胞、抑制VSMC過度增殖為當前預防動脈粥樣硬化發生的有效途徑。

HCY屬于一個代謝中間產物， 已證實是動脈粥樣硬化等心血管疾病發病的獨立危險因子， 決定著動脈粥樣硬化病變嚴重程度[7]。研究發現， HCY對體外培養VSMC、動脈粥樣硬化病灶內VSMC均起到促進增殖作用， 說明通過HCY誘導VSMC增殖會誘發動脈粥樣硬化。而ERS指各種應激原通過誘發內質網腔中錯誤折疊或未折疊蛋白質堆積而激活未折疊蛋白反應（ unfolded protein response， UPR）、細胞凋亡信號通路。結果得出， HCY促進VSMC增殖的同時ERS相關基因表達量上升， 考慮HCY促進VSMC過度增殖過程中可能存在ERS的參與。

丹參化學成分分為分水溶性、脂溶性， 其中丹參酮ⅡA屬于脂溶性， 具有舒張血管、降壓、抗栓等作用， 常被臨床用于治療心血管疾病[8]。本文結果表明， 丹參酮ⅡA可有效通過抑制分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路而阻斷VSMC DNA的合成、異常增殖等， 加上丹參酮ⅡA對CyclinD1、CDK4的表達具有良好的干預效果。丹參酮ⅡA有助于拮抗HCY 誘導VSMC 增殖， 充分體現出丹參酮ⅡA抗VSMC 增殖功效與其自身劑量存在密切聯系， 加之丹參酮ⅡA組Bip基因高表達， 進一步表明ERS是抗動脈粥樣硬化的一種重要機制[9， 10]。

綜上所述， 丹參酮ⅡA對HCY誘導增殖VSMC ERS相關基因Bip表達的具有顯著作用， 適用于動脈粥樣硬化等血管疾病的治療。

參考文獻

[1] 陳芳， 王麗， 沈曉君， 等. 丹參酮ⅡA對大鼠血管平滑肌細胞BIP和CHOP表達的影響. 中國老年學， 2015（8）：2175-2177.

[2] 龔斐， 趙芳， 姚述遠， 等. 天然蝦青素對血管平滑肌細胞增殖的影響及其機制. 中華醫學雜志， 2016， 96（25）：2031-2035.

[3] 周玉利. 丹參酮ⅡA對PDGF-BB誘導的平滑肌細胞蛋白質組的影響. 浙江中醫藥大學， 2016.

[4] 馬艷秋. 丹參酮ⅡA對大鼠心臟纖維化作用及機制的研究. 鄭州大學， 2016.

[5] 陸敬平， 王沛. 丹參酮ⅡA抑制血管平滑肌細胞增殖的機制. 中國循證心血管醫學雜志， 2016， 8（10）：1220-1222.

[6] 陸喆. MCP-1誘導血管平滑肌細胞增殖的機制. 遵義醫學院， 2015.

[7] 翟茂材. 熊果酸抑制血管平滑肌細胞增殖及其機制研究. 華中科技大學， 2015.

[8] 張燕燕. miRNA-181a在PDGF-BB誘導血管平滑肌細胞增殖遷移中的機制研究. 山東師范大學， 2016.

[9] 付強， 張妍， 沈曉君， 等. 丹參酮ⅡA對血管平滑肌細胞內質網應激相關基因表達的影響. 中國實驗方劑學雜志， 2013， 19（14）：280-283.

[10] 曹珊， 陳芳， 劉紫陽， 等. 丹參通脈方激活內質網應激途徑對人主動脈血管平滑肌細胞凋亡的影響. 中華中醫藥雜志， 2017（6）：2662-2664.

[收稿日期：2017-11-07]