miRNAs對胞質附著蛋白1表達調節的研究進展

岑勝壬，黃巧冰

(1南方醫科大學第一臨床醫學院,廣州510515；2南方醫科大學基礎醫學院)

微小RNAs(miRNAs)在調節腫瘤的發生發展、上皮細胞的間質轉化及細胞凋亡等方面起重要作用。胞質附著蛋白1(ZO-1)是緊密連接相關蛋白，近年來研究發現，ZO-1與維持細胞形態和腸黏膜屏障功能等有關。有研究發現，miRNAs可調控ZO-1等表達而調節腫瘤的遷移、血腦屏障和腸屏障等的功能[1]?，F就miRNAs對ZO-1表達的調節作用研究進展綜述如下。

1 微小RNAs與胞質附著蛋白(ZOs)的關系

微小RNAs(miRNAs)是一類長度19～25個核苷酸高度保守的內源性非編碼小分子RNA。miRNAs能特異性識別作用于靶基因的3′末端非翻譯區(3′UTR)，調控靶基因mRNA降解或翻譯，多在基因的轉錄后水平起作用。根據miRNA-mRNA 結合的互補性，miRNAs的調控機制分為完全互補和部分互補，使得1個miRNA可調控多個靶基因，單一靶基因可同時被多個miRNAs調控，由此構成了miRNAs對生理過程的復雜調控網絡。近年研究表明，miRNAs在哺乳動物細胞分化、增殖和凋亡等生理過程中的表達發生明顯改變，在糖尿病控制、腫瘤治療、心血管疾病等人類重大疾病治療的相關基因表達中起重要調節作用[1]。

ZOs是第一個被證實的緊密連接附著蛋白，相對分子質量約225 kD，屬于膜結合鳥苷酸環化酶激活蛋白(MAGUK)家族，主要包括ZO-1、ZO-2、ZO-3三個亞型。ZO-1主要由下列結構域組成：PDZ結構域、SH3(Src同源3)結構域、鳥苷酸激酶(GUK)結構域[2]。ZO-1是構成緊密連接的主要胞漿蛋白，在維持血腦屏障和腸上皮屏障穩定中起重要作用。

ZO-1等細胞間連接蛋白的正常表達有利于維持細胞的正常形態，ZO-1等的表達改變參與上皮間質轉化，改變細胞的形態，影響細胞間的黏附力，而腫瘤細胞由于間充質轉化和細胞形態改變，導致其轉移和侵襲能力提高，因此研究ZO-1表達調節的通路，有利于明確腫瘤的發生發展機制。miRNAs主要在基因的轉錄后水平調節，1個基因可有多個miRNA調節，1個miRNA亦可調節多個靶基因。miRNAs參與多種細胞生理活動，在不同微環境下，miRNAs可對ZO-1等緊密連接蛋白的表達進行正向和負向調節，從而參與不同的病理生理過程。近年研究表明，miRNAs通過調節ZO-1等緊密連接蛋白的表達，影響內皮細胞屏障、腸屏障和血腦屏障等的結構和功能[3]。

2 miRNAs調控ZO-1表達與腸屏障的關系

腸屏障是一道間隔腸內容物與機體的屏障，主要由腸上皮細胞及細胞間連接構成，在維護機體內環境的穩定中起重要作用。近年來研究發現，miRNAs調節ZO-1對維持腸上皮屏障的穩定發揮重要作用。Tang等[4]發現，喂食過量乙醇的小鼠，iNOs表達上調導致腸黏膜細胞miR-212高表達，后者進而下調腸上皮ZO-1表達，闡明了乙醇導致腸滲漏的新機制。Zou等[5]發現，在Caco-2細胞中長鏈非編碼RNA H19過表達而上調miR-675，使ZO-1和E-cadherin的mRNA降解和蛋白合成受抑，導致腸黏膜屏障功能失調，而RNA結合蛋白HuR過表達可抑制H19導致的腸上皮屏障功能失調。在誘導腸屏障損傷中，過表達miR-34c可抑制長鏈非編碼RNA PlncRNA1表達，并抑制靶基因MAZ表達從而抑制ZO-1和Occludin的mRNA和蛋白表達，導致腸屏障損壞，而過表達PlncRNA1則可抑制miR-34c表達，保護腸屏障，該研究為治療炎性腸病奠定了基礎[6]。炎性腸病中，TNF-α能誘導腸上皮細胞損傷，使miR-191a上調導致其靶基因ZO-1的mRNA和蛋白表達下調，黃芩苷可抑制TNF-α誘導的miR-191a表達，提高ZO-1表達，從而防止TNF-α誘導的腸細胞損傷[7]。

3 miRNAs調控ZO-1表達與血腫瘤屏障(BTB)的關系

腦的微血管內皮細胞和其間的緊密連接蛋白如閉鎖蛋白(Claudins)及緊密連接相關蛋白等構成了血腦屏障(BBB)，細胞間的緊密連接是BBB的結構和功能基礎，在控制血液與腦的營養物質交換中起重要作用[8]，而ZO-1是BBB內皮細胞連接結構的重要組成成分。BTB，尤其是腦膠質瘤的BTB，與BBB相似，BTB的存在使腫瘤治療藥物不能進入或進入的藥物濃度達不到治療劑量，導致腦腫瘤不能得到有效治療，所以增加BTB通透性有利于藥物進入，增加療效。ZO-1作為緊密連接蛋白組成成分，下調ZO-1的表達會影響緊密連接結構，從而提高BTB通透性，增強腫瘤治療效果。已有大量研究證明miRNAs功能變化是腫瘤發生發展的重要機制之一，而多種腫瘤中發生表達變化的miRNAs亦可通過多種機制間接調控ZO-1表達，從而調節BTB的通透性，影響腫瘤的進程及治療效果。

有研究發現，在膠質瘤微血管內皮細胞(GECs)中miR-181a表達較正常內皮細胞上調，外源性給予pre-miR-181a過表達miR-181a后，通過抑制其靶基因KLF-6表達，進而阻止KLF-6與ZO-1、Claudin-5和Occludin的啟動子結合，導致mRNA和蛋白質表達進一步下降并使緊密連接結構不連續，進而提高BTB的通透性[9]；該研究還發現，miR-34c在GECs中的表達較正常腦血管內皮細胞明顯升高，通過質粒轉染過表達miR-34c，抑制靶基因MAZ，降低緊密連接相關蛋白ZO-1、Claudin-5和Occludin表達，從細胞旁途徑調節提高BTB的通透性[10]；他們還發現GECs中miR-34a較正常ECs顯著上升，轉染質粒過表達miR-34a使p-PKC-ε、PKC-ε蛋白水平下降，而不是mRNA水平下降，導致ZO-1、Claudin-5和Occludin表達減少和分布改變，從而進一步提高BTB通透性[11]；這些研究為膠質瘤的治療提供了新靶點，但未就miR-181a、miR-34c和miR-34a表達較正常ECs上升的具體機制進行探討，作者只是推測可能與腫瘤微環境釋放各種因子有關。Cai等[12]研究發現，長鏈非編碼RNA TUG1 在膠質瘤血管內皮細胞中高表達，抑制TUG1表達可提高miR-144表達，miR-144可直接抑制熱休克轉錄因子2表達，導致ZO-1、Occludin和Claudin-5表達下調及TJs分布不連續，從而提高BTB通透性。在GECs中miR-18a低表達，而過表達miR-18a則抑制其靶基因RUNX1表達，使RUNX1不能與ZO-1、Occludin和Claudin-5的啟動子結合，導致ZO-1等表達下調和分布改變，從而增加BTB的通透性，miR-18a和RUNXl可作為抗腫瘤藥物通過BTB的潛在靶點，為膠質瘤的治療提供新策略[13]。敲除GECs中長鏈非編碼RNA MALAT1上調miR-140表達，上調的miR-140抑制核因子YA(NFYA)表達，導致ZO-1、Occludin和Claudin-5的啟動子活性下降，從而使ZO-1等mRNA和蛋白表達下降，破壞TJs從而提高BTB通透性[14]。Liu等[15]發現，在GEC中miR-330過表達，低劑量內皮單核細胞活化多肽Ⅱ(EMAPⅡ)通過抑制miR-330-3p表達，上調靶基因PKC-α和p-PKC-α的活性，導致TJs相關蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表達減少，從而使BTB通透性增加。

4 miRNAs調控ZO-1表達與腫瘤發生和轉移的關系

miRNAs在腫瘤的增殖凋亡和轉移中起重要調節作用。上皮間質轉化(EMT)是一個復雜過程，上皮細胞骨架重構失去上皮特征結構而表達間充質細胞的標志物，即上皮細胞間連接蛋白ZO-1等減少而波形蛋白等表達增多，使細胞移動和侵襲能力增強，在腫瘤發生和腫瘤轉移中起重要作用[16]。有研究提示，miRNAs通過調節ZO-1表達而控制腫瘤的轉移和侵襲。另有研究發現，部分miRNAs如miR-9、miR-105和miR-19可下調ZO-1等表達，促進EMT發生，從而導致腫瘤的發生和侵襲；而部分miRNAs如miR-34a、miR-122和miR-203則可上調ZO-1的表達，從而發揮抑制腫瘤發生和侵襲的作用。Miao等[17]用miR-203模擬物處理胰腺癌細胞24 h使ZO-1、Snail和β-Catenin表達上升，并通過Caveolin-1抑制Zeb-1、波形蛋白，纖連蛋白表達而抑制EMT，抑制胰腺癌細胞遷移和侵襲。在肝細胞癌的有關研究中，轉錄因子HNF4α的激活可誘導靶基因miR-122表達，miR-122直接抑制RhoA表達，RhoA/Rock通路受抑制，導致ZO-1等緊密連接蛋白和黏附鏈接蛋白表達上升，而纖維連接蛋白和波形蛋白等表達下降，逆轉EMT，減少肝癌細胞的運動性和侵襲能力，為肝癌治療提供了新方法[18]。在非小細胞肺癌中，miR-129-1-3p過表達可直接抑制促癌因子微球粒蛋白1(MCRS1)表達，使ZO-1、Occludin和DSG2等表達上調，阻止EMT，抑制癌細胞轉移和侵襲[19]。研究[20]發現，miR-638在結直腸癌中低表達，過表達miR-638通過直接抑制SOX2來提高ZO-1、E-Cadherin等上皮樣特征蛋白的表達，而抑制EMT，從而抑制腫瘤的轉移和侵襲。乳腺癌細胞分泌富含miR-105的外泌體，抑制靶基因ZO-1等緊密連接黏附蛋白表達，破壞血管內皮屏障，提高血管內皮細胞的通透性，促進腫瘤的遠處轉移(肺和腦)；通過抑制miR-105，可提高ZO-1等表達，抑制腫瘤肺腦轉移，但不改變腫瘤大小[21]。肺癌細胞缺氧條件下，通過分泌外泌體miR-23a抑制靶基因PHD1/2表達，進而促進HIF-1α表達。miR-23a過表達還可降低ZO-1表達，導致血管新生和內皮細胞通透性增高[22]。

5 miRNAs調控ZO-1表達與其他疾病發生發展的關系

miRNAs對ZO-1的調節除了在BTB和腫瘤的發生和轉移中發揮重要作用外，在其他疾病的病理生理過程亦發揮重要作用。研究發現，用角質細胞模擬皮膚創面生物膜感染時誘導產生miR-106b和miR-146a，miR-146s能直接抑制ZO-1和ZO-2表達，miR-106b可通過作用于外顯子或5′端抑制ZO-2和ZO-1表達而損害皮膚屏障功能?？赏ㄟ^抑制miR-106b和miR-146a表達，為處理慢性傷口提供新方法[23]。在燒傷老鼠中miR-98過表達抑制FIH-1表達，使HIF-1過表達，導致ZO-1蛋白表達減少，進而導致器官微血管屏障損壞，通透性增高，故在燒傷后，miR-98調節FIH表達的通路可作為保護血管屏障功能的靶點[24]。小鼠腦缺血模擬中風后，抑制miR-155表達后，可使Rheb表達上調，抑制Akt活性，而減少ZO-1降解穩定TJs，保護BBB的完整性，可通過抑制miR-155表達為治療腦缺血引起的中風提供方向[25]。用Niaspan治療大鼠糖尿病視網膜病變時，提高miR-126表達，使靶基因Ang-1表達上升，并抑制靶基因VEGF/VEGFR和VCAM-1的表達，從而提高視網膜血管細胞的ZO-1、Claudin-5和Occludin表達，維持血視網膜屏障穩定減緩DR進程[26]。視網膜細胞在高糖條件下，過表達miR-15a/16可顯著下調TGF-β3和SMAD2/3水平，并通過降低VEGF水平，提高ZO-1和Occludin表達，降低視網膜內皮細胞的通透性，保護視網膜內皮屏障[27]。

綜上所述，ZO-1是構成緊密連接蛋白的成分，參與維持血腦屏障、腸上皮屏障和血視網膜屏障等的穩定。miRNAs通過調節ZO-1等緊密連接蛋白表達，在腫瘤侵襲和遷移、血腫瘤屏障通透性及腸上皮間充質轉化的調節中發揮重要作用，闡明miRNAs調節ZO-1表達的機制，可為治療疾病提供多個靶點，改善疾病預后。