血漿內皮微粒水平與顱內動脈狹窄的關系

潘勇，黎紅華,2

(1南方醫科大學附屬武漢臨床學院，武漢 430070；2中國人民解放軍武漢總醫院)

顱內動脈粥樣硬化是缺血性卒中的主要原因，有數據顯示，近50%的缺血性卒中由顱內動脈粥樣硬化狹窄引起，且顱內動脈狹窄越嚴重、病變范圍越廣泛，卒中的復發率越高，預后越差[1]。因此，研究顱內動脈粥樣硬化的危險因素及其預測指標對缺血性卒中的防治有重要意義。血管內皮功能損傷與動脈粥樣硬化的發生發展密不可分。內皮微粒(EMP)是內皮細胞激活或凋亡時釋放的微粒，其水平與血管內皮功能損傷密切相關，目前已受到越來越多學者的關注。近年來動物實驗研究表明，內皮微粒還可通過增加黏附分子(ICAM、VCAM)分泌、減少NO分泌等多種途徑，促進動脈粥樣硬化的形成與發展[2]。既往有學者研究發現，內皮微粒與冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度有關[3]，但內皮微粒與顱內動脈粥樣硬化關系的研究尚少。因此，本研究旨在探討EMP和顱內動脈粥樣硬化狹窄間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6月～2017年2月于中國人民解放軍武漢總醫院神經內科住院并接受頭顱CTA檢查的受試者172例。按是否存在顱內動脈狹窄分為顱內動脈狹窄組121例(顱內動脈病變支數≥1)和無顱內動脈狹窄組(對照組)51例。患者均符合以下標準。入選標準：①年齡40～85歲；②至少有1個以上的下列動脈粥樣硬化危險因素：高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙；③有完善的腦血管影像學檢查和頸部超聲檢查。排除標準：①為排除急性腦梗死、腦出血等急性事件對EMP水平的影響，排除急性腦卒中患者；②為排除混雜因素的影響，排除合并存在明顯的顱外動脈狹窄者(頸部血管狹窄大于50%)；③有癥狀的外周動脈疾病；④炎性疾病、動脈瘤、心房纖顫、肝臟或腎臟疾病、心血管介入手術史、腦部手術史等。顱內動脈狹窄組男82例、女39例，年齡(62.8±10.1)歲。高血壓93例，糖尿病50例，高脂血癥43例，吸煙史60例，既往卒中史22例，冠心病14例，收縮壓(158.2±20.5)mmHg，舒張壓(92.9±14.0)mmHg，HbA1c為6.4%±1.5%，FPG(6.6±2.6)mmol/L，TC(4.8±1.4)mmol/L，TG(1.8±1.3)mmol/L，HDL-C(1.1±0.3)mmol/L，LDL-C(2.4±0.9)mmol/L，Hcy(16.5±11.2)μmol/L，纖維蛋白原(3.6±0.7)g/L，頸動脈中膜厚度(1.1±0.2)mm。對照組男31例、女20例，年齡(60.3±9.1)歲。高血壓34例，糖尿病13例，高脂血癥17例，吸煙史22例，既往卒中史4例，冠心病5例，收縮壓(152.5±21.3)mmHg，舒張壓(91.8±14.2)mmHg，HbA1c為6.3%±1.2%，FPG(5.7±1.6)mmol/L，TC(4.6±0.9)mmol/L，TG(1.7±1.0)mmol/L，HDL-C(1.2±0.3)mmol/L，LDL-C(2.3±0.6)mmol/L，Hcy(14.3±7.8)μmol/L，纖維蛋白原(3.3±0.6)g/L，頸動脈中膜厚度(1.0±0.2)mm。顱內動脈狹窄組的糖尿病患病率、FPG、纖維蛋白原、頸動脈中膜厚度高于對照組，差異有統計學意義(P均<0.05)。兩組間年齡、性別、高血壓、高血脂、吸煙史、冠心病史、既往卒中史及其他生化指標未見統計學差異(P均>0.05)。

1.2 血漿EMP檢測 172例觀察對象于入院第2天清晨空腹抽取肘靜脈血3 mL于枸櫞酸鈉抗凝的試管中，1 200 r/min離心10 min，抽取上清液，15 000 r/min離心30 min，經2次離心后的上清液即為血小板貧瘠的血漿。應用美國BD 公司提供的CD31、CD42兩種熒光素標記的特異性抗體標記樣本，100 μL血漿樣品加入CD31、CD42b抗體各5 μL后，于室溫下孵育20 min，加入3.8 μm標準計數微球、0.8 μm校準微球后，添加PBS緩沖液至500 μL。以美國BD公司FACSCalibur 型流式細胞儀檢測血漿EMP水平，上樣量為106events。EMP定義為大小在0.8 μm及以下的CD31+/CD42b-微粒。

1.3 動脈狹窄的診斷及顱內動脈粥樣硬化狹窄的負荷評估 以頭頸部CTA為檢測手段，按WASID標準和NASCET標準，將血管管腔直徑減少>50%或閉塞定義為顱內或顱外動脈粥樣硬化性狹窄。顱內動脈粥樣硬化狹窄的負荷評估包括顱內動脈狹窄病變的數量及狹窄程度。顱內動脈狹窄數量為狹窄率≥50%的動脈段數量。狹窄程度評分參照Samuels標準[4]，狹窄程度在50%～69%計1分，70%～99%計2分，閉塞計3分。若一個動脈段有多處狹窄，按狹窄最重處計算。

2 結果

2.1 兩組血漿EMP水平比較 顱內動脈狹窄組、對照組EMP水平分別為(224.0±61.5)、(112.3±40.5)個/μL，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。在校正混雜因素如年齡、性別、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、收縮壓、FPG、纖維蛋白原、頸動脈中膜厚度后，二元Logistic回歸分析顯示，EMP水平是顱內動脈狹窄的獨立預測因子(OR=1.047，P<0.01)。

2.2 EMP水平與顱內動脈粥樣硬化負荷間的相關性 按顱內動脈段病變支數分為無明顯狹窄組(血管病變支數小于1支)51例，局限狹窄組(血管病變支數1～2支)61例，廣泛狹窄組(血管病變支數大于2支)60例。等級Logistic回歸分析顯示，在控制可能的混雜因素(年齡、性別、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、收縮壓、FPG、纖維蛋白原、頸動脈中膜厚度)后，EMP(OR=1.037，95%可信區間1.099～3.414)和纖維蛋白原(OR=1.937，95%可信區間1.028～1.046)與顱內動脈狹窄病變范圍呈獨立正相關。按顱內動脈狹窄嚴重程度評分，分為低分組(1分以下)51例、中分組(1～3分)67例、高分組(3分以上)54例。等級Logistic回歸顯示，在控制上述混雜因素以后，EMP(OR=1.030，95%可信區間1.023～1.038)和年齡(OR=1.046，95%可信區間1.006～1.087)與顱內動脈狹窄嚴重程度呈獨立正相關。Spearman相關分析顯示，EMP與顱內動脈粥樣硬化負荷呈正相關(血管段數量：r=0.776,P<0.01；動脈狹窄度評分：r=0.766,P<0.01)。校正可能的混雜因素后，偏相關分析顯示二者之間仍存在相關性(病變血管段數量：r=0.635,P<0.01；動脈狹窄度評分：r=0.663,P<0.01)。

3 討論

EMP是激活或凋亡的內皮細胞釋放出來的微小囊泡，攜帶有母體細胞的mRNA、miRNA、受體、特殊蛋白等物質。在內皮功能受損時，EMP釋放明顯增加，目前，EMP作為反映內皮損傷的指標已被國內外學者認可[5]。近年來研究發現，EMP具有促進動脈粥樣硬化的作用。Jansen等將高糖環境下培養出的EMP，注射至ApoE-/-小鼠血管內。結果與空白對照組小鼠相比，實驗組小鼠的動脈粥樣硬化更明顯，表現為斑塊增大，內皮舒張功能下降。進一步研究發現，EMP可通過以下途徑促進動脈粥樣硬化的形成與發展：①高糖環境下誘導的EMP可促進P38MAPK-ICAM/VCAM信號通路的表達，促進內皮炎癥、損害內皮功能，從而促進動脈粥樣硬化的發生。②EMP通過PI3K/AKT-eNOS-NO通路損害血管內皮舒張功能。③EMP通過miR126-SPRED1-MAPK途徑，導致內皮細胞的遷移和增殖減少，黏附因子和趨化因子增多，從而加快動脈粥樣硬化的發展[6～8]。EMP不僅是顱內動脈狹窄的預測指標，其同時亦可能成為動脈粥樣硬化的一個治療靶點。Diamant等[9]研究表明，他汀類藥物、ACEI類藥物可減少血漿EMP的釋放，但目前關于此類藥物的研究還不夠深入。EMP能否成為動脈粥樣硬化一個新的治療靶點，尚有待進一步研究。

研究中我們發現，顱內動脈狹窄組的糖尿病患病率、FPG、頸動脈中膜厚度、纖維蛋白原水平均高于對照組。糖尿病是動脈粥樣硬化傳統危險因素，有學者研究發現糖尿病病程、FPG與大血管病變關系更為密切，而HbA1c與小血管病變關系更密切[10，11]。這或許可以解釋本研究中顱內動脈狹窄組FPG較對照組升高，而HbA1c無統計學差異。頸動脈中膜厚度作為反映全身動脈粥樣硬化情況的窗口，已成為心腦血管狹窄的預測指標。本研究中纖維蛋白原不僅與顱內動脈狹窄相關，在控制混雜因素后，還與顱內動脈狹窄范圍獨立正相關。既往有少許研究顯示纖維蛋白原與冠狀動脈狹窄嚴重程度獨立相關[12]。但纖維蛋白原作為一種急性時相蛋白受諸多因素的影響，因此，二者的關系尚需進一步研究證實。本研究結果顯示，在校正了年齡、性別、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙、收縮壓、FPG、纖維蛋白原、頸動脈中膜厚度后，血漿EMP水平和顱內動脈狹窄相關。進一步分析發現，在控制混雜因素后，EMP水平與顱內動脈病變的廣泛程度和狹窄嚴重程度呈獨立正相關。表明EMP是獨立的預測顱內動脈狹窄及其嚴重程度的指標之一。目前國內外研究顯示，EMP與動脈粥樣硬化相關疾病有關。既往學者報道，EMP與冠狀動脈狹窄、冠心病、外周血管疾病的發生有關[3，13，14]。但目前EMP與顱內動脈狹窄的關系尚未見研究。本研究中，EMP水平和顱內動脈粥樣硬化負荷間呈正相關的可能原因：糖尿病、高血壓、高血脂等心腦血管病危險因素會引起EMP的升高[10]，因此，EMP水平與顱內動脈粥樣硬化的相關性可能只是各種傳統危險因素的綜合體現。但這種相關性在應用Logistic回歸控制了混雜因素后仍然存在。因此，EMP本身對動脈粥樣硬化發生發展的作用不容忽視。

綜上所述，CD31+/CD42b-內皮微粒可作為顱內動脈粥樣硬化性狹窄嚴重程度的預測指標，臨床通過檢測CD31+/CD42b-內皮微粒，可篩選顱內動脈狹窄高危患者，對缺血性卒中的防治有重要意義。