MMSET在卵巢高級別漿液性癌組織中表達及其對癌細胞侵襲遷移的影響

陳穎,劉鑫慧,畢芳芳,楊清

(中國醫科大學附屬盛京醫院, 沈陽110004)

卵巢癌(OC)是女性常見惡性腫瘤之一，發病率及病死率高。美國癌癥協會預計，2018年美國將新增卵巢癌病患22 240例，死亡病患14 070例[1]。在中國據估計,2015年全國卵巢癌新發病例約5.21萬例,死亡病例約2.25萬例[2]。上皮性卵巢癌(EOC)是卵巢癌中最常見的病理類型，其中卵巢高級別漿液性癌(HGSC)占70%。雖然近年HGSC治療取得一定進展，但病死率仍較高，其中腫瘤發生浸潤轉移是其重要原因之一[3]。多發性骨髓瘤SET結構域蛋白(MMSET)是一種組蛋白甲基轉移酶。MMSET主要在睪丸、胸腺及高度增殖的胚胎組織中表達，與人類胚胎發育等生理過程密切相關[4]。近年來研究表明，MMSET還與人類多種腫瘤的形成相關。研究者陸續在宮頸癌、頭頸部癌等多種癌組織中發現MMSET過表達[5,6]，但國內外關于MMSET在卵巢癌中的研究仍較少。2017年9月～2018年2月，我們檢測了HGSC癌組織中MMSET表達，并探討其對卵巢癌細胞侵襲遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 收集本院2016年12月～2017年5月手術患者的卵巢高級別漿液性腺癌組織45例份，入組患者年齡37～68(53.7±8.64)歲。病理類型均為高級別漿液性癌，有淋巴結轉移者11例，無淋巴結轉移者34例，FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期者16例，Ⅲ～Ⅳ期者29例，腹水量>500 mL者16例，≤500 mL者29例，腫瘤直徑>10 cm者17例，≤10 cm者28例，CA125水平>300 U/mL者25例，≤300 U/mL者20例。正常卵巢組織27例份，因子宮內膜病變行全子宮雙附件切除患者的正常卵巢組織，病理證實無卵巢病變，年齡40～70(52.09±5.11)歲。所有病患術前無放化療、服用激素等治療史，無其他干擾實驗結果的病癥。標本留取符合倫理。卵巢癌細胞系OVCAR3及CAOV3購自上海中科院。TRIzol、逆轉錄試劑、SBYR等購自大連Takara公司。PubMed網站設計并驗證引物后由南京金斯瑞生物科技公司合成。一抗MMSET及GAPDH購自武漢Proteintech公司，山羊抗鼠二抗及山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。胰酶、1640培養基及胎牛血清購自美國HyClone公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Solarbio公司；Lipo3000購自美國Invitrogen公司；細胞培養瓶、PBS、Transwell小室、Matrigel基質膠購于美國Corning公司；MMSET siRNA購自上海吉瑪基因公司。

1.2 MMSET mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。按照Takara公司TRIzol試劑說明書提取RNA，根據RNA沉淀量大小加入適量DEPC水。檢測提取的RNA樣品濃度及純度。取濃度及純度達標的樣品按相應步驟進行逆轉錄及擴增。相對定量法檢測目的基因表達。MMSET正向引物：5′-TGTGTGAGCTGCCATGCTTCCA-3′,反向引物：5′-TGAGCATCCTGCTGCCAGACAA-3′；GAPDH正向引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCCAACAGCG-3′,反向引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。

1.3 MMSET蛋白表達檢測 采用Western blotting法。剪取凍存的組織約20 mg，加入100 μL RIPA對組織進行裂解，靜置30 min。待組織裂解充分后，14 000 g，4 ℃離心30 min，取上清蛋白原液。BCA法定蛋白，余樣品與5×loading Buffer以4∶1的比例混勻并加熱變性(100 ℃ 5 min)，配制5%濃縮膠及10%分離凝膠跑電泳，上樣量30 μg。轉完膜后將目的條帶及內參條帶膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，后加入成比例稀釋的一抗，4 ℃冷房搖床過夜。12 h后洗膜并加入二抗，室溫下孵育2 h，ECL發光。采用Image J軟件對條帶的灰度值分析。

1.4 細胞培養與實驗分組 人卵巢癌細胞系CAOV3及OVCAR3按RPMI1640+10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素)配制的培養基培養。培養環境37 ℃、5%CO2。實驗分2組，si-NC組及si-MMSET組。si-NC組轉染空白質粒，si-MMSET組轉染靶基因質粒。

1.5 siRNA的合成、設計與轉染 siRNA由上海吉瑪基因公司合成，si-MMSET正向引物：5′-GCACUUCCAGGAUAUCAUUTT-3′,反向引物：5′-AAUGAUAUCCUGGAAGUGCTT-3′;si-NC正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。接種細胞于6孔板內貼壁生長至密度達到50%～70%進行轉染，按說明書混合Lipo3000和siRNA,靜置20 min后進行轉染，轉染6 h后將無血清培養基換為完全培養基。48 h后應用Western blotting法檢測轉染效果。

1.6 劃痕面積測算 鋪卵巢癌細胞CAOV3及OVCAR3于6孔板內，細胞融合至70%左右時進行轉染,轉染6 h后使用20 μL的滅菌槍頭垂直于孔板平面進行劃痕，洗去離壁的細胞，加入含2%血清的培養基培養。此時定為劃痕0 h，分別于0、48 h于倒置顯微鏡下拍照記錄劃痕變化。并用Image J軟件計算劃痕面積，用48 h劃痕面積除以0 h劃痕面積，計算出劃痕面積的變化率。

1.7 穿膜細胞數測算 進行Transwell實驗。無血清培養基稀釋Matrigel膠(8∶1)包被小室置于24孔板中，孵箱內過夜。細胞轉染24 h后用胰酶消化并用無血清培養基制成細胞懸液，每個小室上加入約104個細胞，終體積200 μL，下室加入完全培養基500 μL，37 ℃孵育48 h。棄掉小室下室的培養基，95%乙醇固定細胞，約15 min，結晶紫細胞染色，約20 min。使用倒置顯微鏡于4個不同的視野拍照記錄穿膜細胞數，取均值。

1.8 卵巢癌細胞CAOV3及OVCAR3中P-AKT、AKT蛋白表達檢測 采用Western blotting法。接種卵巢癌細胞CAOV3及OVCAR3于6孔板內，貼壁生長至密度達到50%～70%進行轉染，轉染48 h后收集細胞，用Western blotting法檢測siMMSET后卵巢癌細胞P-AKT、AKT蛋白表達。

2 結果

2.1 MMSET在HGSC癌及正常卵巢組織中表達比較 HGSC癌及正常卵巢組織中MMSET mRNA相對表達量分別為2.601 0±0.3145、1.121 0±0.097 7，二者比較，P<0.05。HGSC癌及正常卵巢組織中MMSET 蛋白相對表達量分別為0.942 5±0.076 6、0.616 6±0.063 7，二者比較P<0.05。

2.2 MMSET表達與HGSC患者臨床病理特征的關系 HGSC患者有淋巴結轉移者與無淋巴結轉移患者卵巢組織中MMSET mRNA的相對表達量分別為5.107±2.068、2.262±0.264，二者比較，P<0.05；腹水量≤500 mL與>500 mL者卵巢組織中MMSET mRNA的相對表達量分別為2.290±0.293、4.676±1.457，二者比較，P<0.05；CA125≤300 U/mL與>300 U/mL患者卵巢組織中MMSET mRNA的相對表達量分別為1.756±0.268 1、3.244±0.480 8，二者比較，P<0.05；年齡≤55歲、>55歲卵巢組織中MMSET mRNA的相對表達量分別為2.421±0.468、3.760±1.021，二者比較，P>0.05；FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期患者MMSET mRNA的相對表達量分別為2.467±0.441、3.397±0.827，二者比較，P>0.05；腫瘤直徑≤10 cm及>10 cm患者MMSET mRNA的相對表達量分別為2.836±0.423、3.392±1.272，二者比較，P>0.05。

2.3 轉染后卵巢癌細胞中MMSET表達變化 si-NC組及si-MMSET組CAOV3卵巢癌細胞MMSET相對表達量分別為0.958 6±0.1472、0.445 4±0.051 6，OVCAR3卵巢癌細胞MMSET相對表達量分別為0.830 7±0.079 6、0.530 4±0.067 0，兩組比較，P均<0.05。

2.4 MMSET基因沉默后卵巢癌細胞遷移能力比較 48 h后卵巢癌細胞CAOV3 si-NC組及si-MMSET組的劃痕面積變化率分別為47.21%±5.38%、22.22%±6.20%，兩組比較，P<0.05；卵巢癌細胞OVCAR3 si-NC組及si-MMSET組的劃痕面積變化率分別為57.52%±2.76%、28.03%±2.48%，兩組比較，P<0.05。

2.5 MMSET基因沉默后卵巢癌細胞侵襲能力比較 Transwell小室實驗結果顯示，卵巢癌細胞CAOV3 si-NC組及si-MMSET組的穿膜細胞數分別為(27±4)、(10±2)個，卵巢癌細胞OVCAR3 si-NC組及si-MMSET組的穿膜細胞數分別為(70±5)、(33±3)個，兩組比較，P均<0.05。

2.6 MMSET基因沉默后卵巢癌細胞中P-AKT蛋白表達比較 si-NC組及si-MMSET組卵巢癌細胞CAOV3中P-AKT蛋白相對表達量分別為0.457 1±0.152 8、0.223 9±0.121 0，卵巢癌細胞OVCAR3中P-AKT蛋白相對表達量分別為0.6570±0.1068、0.439 9±0.100 2，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

HGSC惡性度極高，患者5年存活率低于50%[7]。研究表明，表觀遺傳學的改變是影響腫瘤發生的重要因素之一。其中，組蛋白甲基轉移酶是抗癌治療的重要靶點，因其酶活性能得到有效控制。MMSET屬于組蛋白甲基轉移酶家族的一員，其SET結構域具有催化能力，能使得H3K36二甲基化。MMSET表達與人類胚胎發育過程密切相關，MMSET基因缺陷會導致以生長發育遲緩、先天性心臟缺陷為病理特征的Wolf-Hirschhorn綜合征的發生[8]。MMSET的致癌作用最早見于多發性骨髓瘤，(4;14)(p16;q32)易位導致MMSET基因過表達[9]。

本研究結果顯示，MMSET在HGSC癌組織中過表達且與腹水量、CA125水平及淋巴結轉移相關。該結果與Yang等[10]研究結果基本一致。查閱近年來國內外相關文獻表明，過表達的MMSET能促進前列腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤的侵襲遷移進程[11]。然而，關于MMSET是否參與卵巢癌細胞的侵襲遷移進程目前尚不清楚。為探究MMSET對卵巢癌細胞侵襲遷移的影響，本研究通過Transwell小室實驗及劃痕實驗分別測定了MMSET基因下調后卵巢癌細胞侵襲遷移能力的變化。結果表明，MMSET下調后細胞的侵襲遷移能力顯著降低。可見MMSET在卵巢癌細胞的侵襲遷移中起到重要作用，然而關于MMSET調控卵巢癌細胞侵襲遷移的具體機制目前尚未深入研究。Lu等[11]在骨肉瘤中同樣發現上調的MMSET基因能促進骨肉瘤細胞的侵襲遷移進程，且該過程可能是通過抑制E-cadherin表達實現。異常表達的miRNAs在癌癥細胞的起始、進展和轉移過程起重要作用。

AKT信號通路作為原癌基因通路在包括卵巢癌在內的多種惡性腫瘤中處于激活狀態，且過度激活的AKT信號通路與卵巢癌的增殖、侵襲轉移、細胞周期進程、血管形成及耐藥等惡性行為密切相關[12]。本研究發現基因沉默卵巢癌細胞中MMSET表達后，P-AKT蛋白表達隨之減少，表明MMSET可能是通過磷酸化激活AKT信號通路參與卵巢癌的發展進程，該結果與Li等[13]研究結果相符。此外，Li等[13]研究還表明MMSET與PI3K/AKT通路間存在相互調控的環路關系。然而在卵巢癌中是否存在該調控環路尚需進一步實驗驗證。

綜上所述，MMSET在HGSC中過表達，過表達的MMSET與卵巢癌患者的腹水量、CA125水平、淋巴結轉移等臨床病理特征及卵巢癌細胞的侵襲遷移能力相關，且MMSET可能通過調控AKT信號通路來參與卵巢癌的惡性進程。