芹菜素對膠質瘤U87細胞的抗增殖作用及其機制研究

貢偉一 程 峰 劉 華 張曙光

江蘇大學附屬昆山醫院神經外科，江蘇 蘇州 215300

惡性膠質瘤是嚴重威脅人類健康的顱內最常見的原發性腫瘤之一，易復發，難治愈，迄今沒有滿意的治療方法，即使聯合手術、放療和化療，其中位數生存期也只有診斷后12～14個月，而且在過去的幾十年內進展不大[1-3]。芹菜素(apigenin) 是天然存在的一種黃酮類化合物，有多種藥理活性，如降血壓、鎮靜、抗菌以及雌激素樣作用等[4-5]，近年來發現其對乳腺癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤也具有抑制作用[6-7]。但芹菜素對膠質瘤的作用國內外基礎研究及臨床應用仍然比較少。本實驗研究主要探討芹菜素抗膠質瘤的作用及其機制。

1 材料與方法

1．1材料與試劑人膠質瘤U87細胞購自中國科學院上海細胞研究所。芹菜素購自美國Sigma有限公司。高糖DMEM培養基和胎牛血清購自美國gibco公司。WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京碧云天生物科技公司。Bak1 抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。BAK1 siRNA購自EnoGene公司。

1．2細胞培養和傳染U87細胞培養于10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，每隔1～2 d更換1次培養基，鋪瓶率達到70%～80%時，胰酶消化傳代。選擇指數增長的細胞轉染BAK1 siRNA，24 h后更換培養基，流式分析轉染效率。

1．3 WST-1實驗檢測細胞增殖能力細胞經胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度至每孔加入100 μL 2 000個細胞，種植于96孔板，24 h后，給予0、20、40 μmol/L芹菜素，每組設6個復孔，培養72 h，每孔加入10 μL WST-1溶液，在細胞培養箱內繼續孵育1 h，把96孔板置于搖床上搖動1 min，以充分混勻待檢測體系，測定450 nm波長處的吸光度值。

1．4流式細胞儀檢測細胞凋亡率0、20、40 μmol/L芹菜素處理U87細胞48 h后，把細胞培養液吸出至離心管內，PBS洗滌1次，加入適量胰酶細胞消化液消化細胞。吸除胰酶細胞消化液，加入收集的細胞培養液把細胞輕輕吹打下來，轉移到離心管內，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。取5萬～10萬重懸的細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 mL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。最后用流式細胞儀檢測。

1．5 Western Blot鑒定40 μmol/L芹菜素處理U87細胞48 h后，用裂解液裂解細胞后提取總蛋白，加入5×上樣緩沖液，煮沸后，在預制膠中加入10 μL樣品，電泳1.5 h后，切膠轉膜，300 mA 電流下4 ℃轉膜90 min，37 ℃封閉1 h，Bak1抗體1：1 000稀釋后37 ℃孵育1.5 h后，孵育二抗1.5 h。顯影液顯影，凝膠成像儀成像。

1．6統計學方法實驗結果采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，數據采用單因素方差分析，P<0.05提示差異有統計學意義。

2 結果

2．1芹菜素抑制U87細胞增殖如圖1A，U87細胞用20、40 μmol/L芹菜素干預24 h后，細胞增殖能力明顯下降，并隨著藥物濃度和時間的增加，細胞的生長抑制率也明顯增加。而U87細胞采用Bak1 siRNA預處理后，芹菜素對U87細胞的抑制能力明顯下降(圖 1B)。

圖1 A：20、40 μmol/L芹菜素對U87細胞干預72 h的生長抑制率；B：Bak1 siRNA預轉染U87細胞24 h后20、40 μmol/L芹菜素對U87細胞干預72 h的生長抑制率

2．2芹菜素誘導U87細胞凋亡如圖 2A，U87細胞用20、40 μmol/L芹菜素干預24 h后，U87細胞出現凋亡，并隨著藥物濃度和時間的增加，細胞凋亡率也明顯增加。而U87細胞采用Bak1 siRNA預處理后，芹菜素誘導U87細胞的凋亡率也明顯下降(圖 2B)。

圖2 A：20、40 μmol/L芹菜素對U87細胞干預72 h的細胞凋亡率；B：Bak1 siRNA預轉染U87細胞24 h后20、40 μmol/L芹菜素對U87細胞干預72 h的細胞凋亡率

2．3芹菜素抑制Bak1蛋白表達進一步我們利用20、40 μmol/L芹菜素處理U87細胞72 h后，Western Blot檢測U87細胞Bak1蛋白的表達。我們研究表明芹菜素可明顯抑制U87細胞中Bak1蛋白的表達，并且隨著藥物濃度的增加，抑制效應更加明顯(圖3)。

圖3 20、40 μmol/L芹菜素對U87細胞Bak1蛋白的表達的影響 A：凝膠電泳圖；B：直方圖

3 討論

芹菜素又稱芹黃素，是天然存在的一種黃酮類化合物, 有植物雌激素之稱, 廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中，其中芹菜中含量最高。目前已經作為藥物和保健產品用來控制血壓及軟化血管的用途。芹菜素的化學名稱是4'，5，7-三羥基黃酮，分子式為C15H10O6，分子量為270，不溶于水，易溶于乙醇、二甲基亞砜(DMSO)，具有多種藥理活性，如抗菌、降血壓、鎮靜等。但近年來研究發現其對腫瘤也具有一定的抑制作用[8-12]：如抵抗腫瘤的增殖和侵襲能力，抑制血管生成以及促使細胞凋亡等作用。

MAFUVADZE等[13-14]研究表明，芹菜素抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲及血管生成能力，并且促使部分腫瘤細胞發生凋亡。KUO等[15-17]研究表明，芹菜素可誘導胃癌細胞發生凋亡，及誘導凋亡的作用呈現藥物濃度依賴性，且證實芹菜素誘導胃癌細胞凋亡的機制主要是通過bax/bcl-2-caspase-3、9的線粒體凋亡通路活化實現的。SHUKLA等[18-20]研究發現，芹菜素有效抑制前列腺癌細胞增殖，其發揮作用的機制是誘導前列腺癌細胞細胞周期阻滯于G2/M期，這種抑制作用同樣表現出現藥物濃度依賴。GAO等[21-23]研究發現，芹菜素能誘導Hep G2人肝癌細胞的分化，有效地降低γ-GT 的活性和AFP 的表達。LEE等[24-26]研究證實芹菜素可通過抑制P34Cdc2 激酶的活性從而抑制SW480、HT-29和Caco2三種結腸癌細胞增殖。

而芹菜素對膠質瘤的基礎研及臨床應用研究仍然比較少。國內僅楊志英等[27]研究報道芹菜素可通過誘導p21、p53 蛋白表達抑制U251 膠質瘤細胞生長。而國外期刊上，WANG等[28]研究發現，芹菜素可通過上調TNF-α水平，過表達Bid蛋白及下調Bcl-xL蛋白增強Hydroxygenkwanin抗膠質瘤作用。但FENG等[29-30]研究發現，芹菜素對U251膠質瘤干樣細胞抗增殖作用效果不明顯。本實驗研究中我們發現芹菜素具有良好的抗膠質瘤效應，20、40 μmol/L芹菜素即可抑制膠質瘤細胞增殖，并促進部分膠質瘤細胞發生凋亡，實驗表明膠質瘤細胞用芹菜素干預后Bak1蛋白表達明顯上調，而抑制Bak1蛋白表達后，芹菜素的這種抗膠質瘤作用明顯減弱，表明芹菜素抗膠質瘤作用主要依賴于調控Bak1蛋白表達。

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(收稿2017-07-13 修回2017-11-20)