p38MAPK在腦缺血后處理大鼠海馬區的表達與意義

孫鴻雁 劉 宇

天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150

腦缺血后處理(ischemic postconditioning，IPostC)指于缺血腦組織恢復再灌注前給予多次短暫的缺血/再灌注處理。研究已證實腦缺血后處理可以增強腦組織對缺血耐受性，減輕再灌注腦損傷，具有內源性保護作用[1]。但是腦缺血后處理的腦保護作用機制目前尚不明確。研究發現，全腦缺血大鼠模型中，缺血區神經元p38MAPK活性明顯增強，神經元凋亡增加，指出p38MAPK參與全腦缺血再灌注損傷的過程[2]。本研究通過建立全腦缺血大鼠模型，觀察腦缺血后處理后大鼠海馬區神經元形態學變化及p38MAPK表達情況，探討腦缺血后處理的腦保護作用機制，為臨床治療腦缺血再灌注損傷提供新的理論依據。

1 材料與方法

1．1實驗動物與分組健康雄性SD大鼠96只，體質量300～350 g，購于北京維通利華實驗動物中心。隨機分為假手術組(Sham組)、腦缺血組(IR組)、缺血后處理組(IpostC組)，每組32只。各組按恢復再灌注時間又分為6 h、24 h、48 h、72 h 4個時間亞組，每個時間點8只。

1．2主要實驗試劑與藥品兔抗P38(Tyrl82)多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；一抗稀釋液(碧云天生物技術研究所)；羊抗兔二抗工作液(北京博奧森生物技術有限公司)；濃縮型DAB試劑盒(中杉金橋)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1．3模型制作與處理按照改良的Pulsinelli四血管閉塞法制作全腦缺血大鼠模型，10%水合氯醛腹腔麻醉后，以枕后正中線切頭部皮膚，逐層分離直至暴露第一頸椎椎狀孔后，電凝雙側椎動脈；沿頸正中切開皮膚，逐層分離直至分離雙側頸總動脈(CCA)后埋線備用。均消毒后縫合切口，恢復24 h后夾閉雙側CCA 20 min。模型成功判定標準：大鼠昏迷、翻正反射消失、雙側瞳孔放大、眼睛顏色發白。Ipost C組大鼠恢復再灌注前給予短暫的缺血/再灌注處理，時間各15 s，重復3次。Sham組大鼠只切開頭部皮膚不電凝，分離頸總埋線不夾閉。各組在恢復再灌注后6 h、24 h、48 h、72 h處死大鼠留取實驗標本。

1．4 HE染色切片常規脫蠟至水，經蘇木精水溶液染色及1%鹽酸乙醇分化后，水化返藍30 min，0.5%伊紅溶液復染，再經梯度酒精脫水二甲苯透明后由中性樹膠固定封片。結果判定與計數：每個時間點隨機選取4只大鼠，每只大鼠選取5張切片，光學顯微鏡(40×10)下隨機觀察5個不重疊視野。可見壞死神經元細胞核變形或消失，胞核深染，細胞排列疏松，間質水腫；存活神經元細胞核仁明顯，排列整齊。采用Motic6.0數碼醫學圖像分析系統計數海馬區存活與壞死神經元細胞個數，壞死率為壞死神經元細胞與總神經元細胞之比，取其平均值進行統計分析。

1．5免疫組織化學染色采用標準SABC法，切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫浸泡15 min阻斷內源性過氧化物酶活性，經高壓修復抗原后滴加磷酸化兔抗鼠p38MAPK抗體(工作濃度1：200)，冰箱過夜后復溫1 h，滴加二抗，37 ℃溫箱孵育1 h，經DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明后封固定片。緩沖液為PBS，時間5 min×3次。結果判定與計數：與HE染色共用大鼠，每只動物選取4張切片，光學顯微鏡(40×10)視野下，每張切片觀察4個視野。P38MAPK陽性表達為胞核棕黃色，應用目鏡網格測試系統，計數棕黃色細胞數，取均值進行統計分析。

1．6免疫印跡檢測相應時間點處死大鼠，冰上操作分離海馬組織，保存于EP管內，加入PIRA裂解液，考馬斯亮藍法蛋白質定量，樣品制備，PADF轉膜，脫脂奶粉封閉，加入抗體(p38MAPK稀釋濃度為1：1 000)，4 ℃冰箱過夜后室溫恢復2 h，TBST洗膜，滴加二抗(TBST 1：2 000稀釋)，孵育1 h，ECL顯色。Bio-Rad凝膠成像分析系統對條帶進行曝光、顯影和分析。以目的條帶與內參β-actin的吸光度比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

2 結果

2．1各組大鼠形態學觀察Sham組大鼠各個時間點海馬區神經元細胞結構完整，排列緊密，細胞核形態正常，核仁清晰，染色均勻；IR組大鼠海馬區神經細胞結構損傷嚴重，細胞核變形、固縮深染甚至消失，細胞排列結構疏松，隨時間逐漸出現空泡結構。IpostC組大鼠海馬區神經元細胞結構損傷較IR組明顯改善，空泡結構減少。與Sham組比較，IR組各時間點神經元細胞壞死率明顯增加，且隨時間變化呈遞增趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)；與IR組比較，IpostC組神經元細胞壞死率明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠海馬區神經元細胞壞死率比較

注：與Sham組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

Sham組 IR組 IpostC組圖1 各組大鼠24 h海馬區神經元細胞HE染色結果(40×10)

2．2各組大鼠磷酸化p38MAPK免疫組化染色結果比較Sham組見少量磷酸化p38MAP胞漿弱表達；與Sham組比較，IR組神經元細胞各時間點磷酸化p38MAPK陽性細胞表達明顯增加，時間表達變化為：6 h陽性表達開始增加，24 h表達到高峰，48 h、72 h表達下降(P<0.05)；與IR組比較，IpostC組神經元細胞各時間點磷酸化p38MAPK表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠海馬區磷酸化p38MAPK陽性細胞表達結果

注：與Sham組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

Sham組 IR組 IpostC組 圖2 各組大鼠24 h海馬區磷酸化p38MAPK免疫組化染色結果(10×40)

2．3各組大鼠海馬區磷酸化p38MAPK免疫印跡結果以p38MAPK光密度值/β-actin光密度值表示p38MAPK蛋白的相對表達量。Sham組大鼠海馬區各個時間點見少量磷酸化p38MAPK蛋白表達；與Sham組比較，IR組海馬區各時間點磷酸化p38MAPK蛋白表達量明顯增加，時間表達變化為6 h開始表達增加，24 h表達量最高，48 h、72 h表達逐漸下降(P<0.05)；與IR組比較，IpostC組海馬區各時間點磷酸化p38MAPK蛋白表達量明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組大鼠海馬區磷酸化p38MAPK蛋白免疫印跡結果

注：與Sham組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

圖3 Western blotting各組大鼠海馬區磷酸化p38MAPK蛋白表達情況

3 討論

眾多實驗研究已證實了缺血預處理(ischemic preconditioning，IPC)在局灶性和全球腦損傷的大鼠模型中的神經保護作用，并將IPC后的大腦保護劃分為兩個窗口[3]：一個是早期急性期，其保護作用在IPC后幾分鐘內存在，但幾個小時后會消失；另一個是IPC發生大概24 h后期的保護窗口，在許多研究中被認為更有效，持續更長。隨后的研究指出再灌注后短暫的缺血性腦缺血也是保護性的，這種現象被稱為后處理(post conditionin，IPostC)[4-5]。由于IPostC的時間窗更易掌控，更具臨床應用價值，所以其成為了過去十年學者研究的熱點。與IPC類似，IPostC最初被證實為心肌缺血后的保護作用，并被應用到臨床經皮冠狀動脈介入治療前干預[6]。隨后研究證實IPostC同樣具有腦保護作用[7-8]。2008年PIGNATARO等在大鼠永久性中動脈閉塞模型中證實腦缺血后處理能夠減輕腦梗死面積，改善腦組織的神經功能障礙[9]。國內學者WANG等[10]指出10 min短暫全腦缺血后立即給予多次短暫再灌注/缺血處理，可以明顯降低再灌注7 d后海馬區以及頂葉皮腦質層神經元細胞的損傷和壞死。本研究中，與IR組比較，IPostC組大鼠海馬區神經元細胞結構損傷明顯改善，神經元細胞壞死率明顯下降。進一步證實腦缺血后處理可以改善神經細胞功能，減少神經元細胞死亡，具有腦保護作用。

雖然腦缺血后處理的腦保護作用已經得到證實，但其內在機制尚不明確。眾多研究認為腦缺血后處理主要通過激活或抑制相關自由基、凋亡因子及炎癥因子等的表達，進而調控相應細胞信號通路，發揮缺血后處理的內源性神經保護作用[11]。在局灶性腦缺血或是短暫性全腦缺血發生后，如果腦組織缺血狀態持續存在下去，神經元細胞最終將會走向壞死或凋亡，這其中涉及一系列基因的激活和其表達調控的改變[12]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)屬于MAPK超家族激酶，包括4個亞型：p38α、p38β、p38γ(SAPK3、ERK6)和p38δ(SAPK4)，分布于全身各處組織細胞[13]。p38MAPK 也是細胞內信號轉導通路中的重要信號分子，在細胞外多種應激原(細胞因子、生理應激等)的刺激下雙膦酸化，參與機體生理、病理過程中如細胞生長、細胞凋亡、炎癥及應激反應的調控等[14-15]。近年來研究指出p38MAPK與腦缺血后神經元細胞的死亡密切相關。在全腦缺血再灌注損傷大鼠模型中發現，缺血區的神經元細胞內 p38活性明顯增強，其下游Bcl-xl、Bax和AIF等凋亡基因過度表達，誘導神經元細胞凋亡，而應用p38MAPK活性抑制劑SB203580能明顯減輕大腦局部缺血后的再灌注損傷[16]。國內學者李浩等[17]報道，大鼠局灶性腦缺血再灌注24 h，缺血區腦組織 p38的活性增強并伴隨神經元的凋亡，表明p38在腦缺血后神經元凋亡的過程中起重要作。在本研究中采用免疫組化和WesternBlot法檢測大鼠海馬區磷酸化p38MAPK表達發現，IR組各時間點p38MAPK表達均較Sham組明顯增加，其中在24 h表達最強，相應的HE染色結果顯示，IR組各時間點神經元細胞壞死率較Sham組明顯增加。說明p38MAPK參與腦缺血再灌注后神經元細胞死亡，與以往研究相一致。那么腦缺血后處理對p38MAPK表達有何影響，p38MAPK是否為腦缺血后處理腦保護作用潛在機制之一，目前尚無報道。本研究進一步檢測了IPostC組大鼠海馬區p38MAPK表達發現，與IR組比較，IPostC組各時間點p38MAPK表達明顯下降，相應HE染色結果是IPostC組神經元細胞壞死率較IR組明顯下降，提示腦缺血后處理可能通過降低海馬區神經元細胞p38MAPK表達，減少神經元細胞死亡，發揮腦保護作用。腦缺血后處理作為一種新型的腦保護措施其研究還處于初始階段，目前尚未應用于臨床，有待我們進一步揭示腦缺血后處理的保護作用機制，以期早日應用于臨床

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(收稿2017-04-11 修回2017-12-06)