高效液相色譜法測定鹽酸黃酮哌酯原料和制劑中有關物質

沈丹丹 ，曾 杰 ，梁涵雁 ，姜學美 ，蔣 晨

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121； 2.重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶401121； 3.福安藥業＜集團＞股份有限公司，重慶 401121）

鹽酸黃酮哌酯為第2代尿失禁治療藥物，具有抑制腺苷酸環化酶、磷酸二酯酶及拮抗鈣離子作用，并有弱抗毒蕈堿作用，對泌尿生殖系統的平滑肌具有選擇性解痙作用，臨床主要用于治療各種尿路疾病引起的尿頻、尿急、尿痛、排尿困難及尿失禁等癥[1-7]。國內鹽酸黃酮哌酯原料有6家企業生產，但現在市場供應的原料只有2家企業生產。目前，國內鹽酸黃酮哌酯有片劑和膠囊劑，有 0.1 g和 0.2 g 2個規格，其中片劑有 10家生產企業，膠囊劑有2家生產企業。本次國家藥品抽樣評價共抽取樣品107批，全部為片劑，涉及生產企業6家，未抽到膠囊劑。

鹽酸黃酮哌酯原料、片劑和膠囊劑的現行質量標準均為2015年版《中國藥典（二部）》[8]，其有關物質檢查方法均為薄層色譜（TLC）法，曾有報道采用高效液相色譜(HPLC)法測定鹽酸黃酮哌酯含量[9]，但目前國內尚無鹽酸黃酮哌酯有關物質測定方法的研究報道。國內上市的鹽酸黃酮哌酯原料和制劑有關物質執行標準均為現行藥典標準，采用薄層色譜(TLC)法。該方法為半量法，操作比較煩瑣，方法靈敏度較低，人為判斷較主觀，且僅控制雜質3-甲基黃酮-8-羧酸。107批樣品按照現行質量標準檢驗，僅有30批樣品檢出已知雜質A（3-甲基黃酮-8-羧酸），僅1批樣品檢出未知雜質，說明現行藥典有關物質測定方法專屬性和靈敏度均較差，檢查結果不能反映藥品中雜質的真實含量。美國藥典（USP39）[10]、英國藥典（BP2016）[11]收載的鹽酸黃酮哌酯原料有關物質檢查方法均為HPLC法，但色譜條件和雜質限度不相同；鹽酸黃酮哌酯片有關物質USP39采用HPLC法，BP2016為TLC法。USP39收載的原料雜質譜包括3-甲基黃酮-8-羧酸（雜質A）、3-甲基黃酮-8-羧酸甲酯（雜質 B）、3-甲基黃酮-8-羧酸乙酯（雜質C），BP2016收載的原料雜質譜包括3-甲基黃酮-8-羧酸（雜質A）、3-甲基黃酮-8-羧酸乙酯（雜質B）、3-甲基黃酮-8-羧酸異丙酯（雜質C），因此考慮結合USP39及BP2016的雜質譜。本研究中建立了同時測定 3-甲基黃酮-8-羧酸（雜質 A）、3-甲基黃酮 -8-羧酸甲酯（雜質B）、3-甲基黃酮 -8-羧酸乙酯（雜質C）及3-甲基黃酮-8-羧酸異丙酯（雜質D）的HPLC法，并制訂合理的質控指標，供現行藥典質量標準提高參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters e2695型高效液相色譜儀，包括Waters 2489型紫外檢測器（美國Waters公司）；K51502653型電子天平（德國賽多利斯公司）。

試藥：鹽酸黃酮哌酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100964-200701，含量為100.0%）；雜質A（3-甲基黃酮-8-羧酸）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100965-200701，含量為100.0%）；雜質 B（3-甲基黃酮-8-羧酸甲酯）對照品（USP，批號為1.0，含量 100.0% ）；雜質 C（3- 甲基黃酮 -8- 羧酸乙酯）對照品（BP，批號為 156.02.08.01，含量為 99.9% ）；雜質 D（3-甲基黃酮 -8-羧酸異丙酯）對照品（BP，批號為2417，含量為99.4%）。鹽酸黃酮哌酯片，A廠(批號為 20150602），B 廠(批號為 150504），C 廠(批號為20160304），D 廠 (批號為 20150501），E 廠 (批號為03A160207），F 廠(批號為 20150701），規格均為每片0.2 g；鹽酸黃酮哌酯原料，F 廠(批號為 20160502），G廠(批號為FA160142）。己烷磺酸鈉（白賽勤化學技術有限公司，批號為20161125），三乙胺（成都市科龍化工試劑廠，批號為20161011），磷酸（重慶川東化工有限公司，批號為20170601），均為分析純；乙腈（安徽時聯特種溶劑股份有限公司，批號為6308IS317）為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm），十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：緩沖液（取1 g己烷磺酸鈉，加水適量使溶解，加三乙胺1 mL和磷酸 1 mL，加水稀釋至 650 mL，搖勻）-乙腈（65∶35）等度洗脫1 min，待第1個色譜峰（鹽酸黃酮哌酯峰）洗脫完畢后，線性梯度洗脫(見表1)；檢測波長：293 nm；流速：1.0 mL ／min；進樣量：20 μL。取混合對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，先以流動相等度洗脫，待第1個色譜峰（鹽酸黃酮哌酯峰）洗脫完畢，按表1進行線性梯度洗脫。鹽酸黃酮哌酯、雜質A、雜質B、雜質 C、雜質D依次出峰，各峰間分離度均符合規定，色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取本品細粉適量（約相當于鹽酸黃酮哌酯100 mg），置100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。取鹽酸黃酮哌酯對照品、雜質A對照品、雜質B對照品、雜質C對照品、雜質D對照品各約10 mg，精密稱定，分別置100 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為對照品貯備液；精密量取鹽酸黃酮哌酯對照品貯備液1.0 mL，雜質 A、雜質 B、雜質C及雜質 D貯備液各3.0 mL，置100 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.3 專屬性試驗

按照各個廠家處方配制混合輔料，精密量取輔料適量，依法配制成輔料溶液，精密量取續濾液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在此條件下，空白溶劑、空白輔料均不干擾有關物質的測試，方法專屬性良好(見圖 2)。

2.4 破壞性試驗

光照破壞：取紫外光(254 nm)下照24 h的鹽酸黃酮哌酯原料25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加溶劑使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

氧化破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加30%過氧化氫5 mL，放置5 min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

酸破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料25 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加 1.0 mol／L 鹽酸 1 mL，放置 10 min，分別加1.0 mol／L氫氧化鈉1 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

堿破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料25 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加 1.0 mol／L 氫氧化鈉 1 mL，放置10 min，分別加 1.0 mol／L 鹽酸 1 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖

高溫破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料適量，分別置烘箱中60℃條件下放置24 h，取出放至室溫，精密稱定25 mg，置25 mL容量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

高濕破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料適量，分別在溫度為25℃、相對濕度為92.5%條件下放置10 d，取出，放至室溫。取本品各約25 mg，置25 mL容量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

未破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料適量，依法制備供試品溶液。

精密量取上述供試品續濾液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖3)。按峰面積歸一化法計算雜質含量，結果見表2。與未破壞樣品雜質含量比較，結果F廠和G廠家的原料對堿均不穩定。其中，F廠原料堿破壞條件下雜質A含量（58.60%）顯著性增加，G廠原料在強堿條件下雜質A含量（2.10%）也增加，表明在強堿條件下容易降解產生雜質A。其他條件下雜質含量基本無變化，表明供試品溶液對光、高溫、高濕、酸及氧均比較穩定。

2.5 線性關系考察

稱取鹽酸黃酮哌酯對照品10.81 mg，雜質A對照品 9.74 mg，雜質 B 對照品 10.21 mg，雜質 C 對照品10.30 mg，雜質 D 10.77 mg，精密稱定，分別置 100 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為對照品貯備液。精密量取鹽酸黃酮哌酯對照品貯備液1.0 mL，雜質 A，B，C，D 貯備液各 0.30，0.75，1.50，3.00，4.50，6.00 mL，分別置100 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。取混合對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程。結果見表3。

2.6 各雜質的校正因子計算

根據各雜質和鹽酸黃酮哌酯線性試驗中線性曲線斜率，計算各雜質與鹽酸黃酮哌酯的曲線斜率之比即為校正因子。結果見表 3。可見，雜質 A，B，C，D校正因子均不在0.90～1.10范圍內，故不能采用自身對照法測定雜質含量。

圖3 破壞性試驗高效液相色譜圖

2.7 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液20 μL，平行6次，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果見表3。可見，儀器精密度良好。

表2 F廠和G廠原料破壞性試驗結果（%）

表3 方法學考察試驗結果

2.8 加樣回收試驗

取本品內容物細粉適量（約相當于鹽酸黃酮哌酯100 mg），精密稱定，平行12份，分別置100 mL容量瓶中。分別精密加入雜質 A，B，C，D 質量濃度為 100 μg／mL的對照品溶液 0.3，3.0，6.0 mL，各 3 份，用流動相稀釋至刻度，搖勻，使各雜質質量濃度約相當于供試品溶液測定質量濃度的 0.03% ，0.30% ，0.60% ；最后 2 份用流動相稀釋至刻度，搖勻；將上述各溶液超聲10 min，放冷，濾過，取續濾液作為供試品溶液。另精密量取雜質A，B，C，D對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每1 mL中含3 μg的混合溶液作為對照品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法分別計算每份供試品中各雜質的總量，計算回收率。結果見表3。

2.9 定量限與檢測限測定

精密量取2.5項下混合對照品溶液適量，用溶劑逐級稀釋成系列質量濃度，吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比（S／N）3∶1計算各成分的檢測限，以信噪比（S／N）10∶1計算定量限。結果見表 3。

2.1 0 穩定性試驗

取鹽酸黃酮哌酯片（F廠，批號為20160102）適量，研細，按 2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，1，2，3，4，6，8，12，16，20 h 時吸取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算各已知雜質、其他單個最大雜質、其他總雜質峰面積的 RSD，以評價溶液的穩定性。雜質A在20 h內峰面積的 RSD為2.9%，說明雜質A不穩定（在6 h內的 RSD為0.4%，說明雜質A在6 h內穩定）；雜質B及雜質C在20 h內的 RSD分別為1.6%和0.9%，低于2.0%；雜質D未檢出；其他單個最大雜質在20 h內的 RSD為0.6%；總雜質在6 h內的 RSD為0.2%，表明供試品溶液在6 h內穩定性好。

2.1 1 耐用性試驗

色譜柱：色譜柱選用 Phenomenex Gemini C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），Phenomenex Luna C18柱（150mm ×4.6mm，5μm），資生堂Spolar C18柱（150mm ×4.6 mm，5 μm）及島津 Inertsil ODS-C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），其他條件保持不變，精密量取 2.1 項下系統適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果不同種類的色譜柱對分離度無明顯影響，本方法對色譜柱的種類耐用性強。

柱溫：將柱溫分別設定為25，30，35℃，其他條件保持不變，精密量取 2.1項下系統適用性溶液 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果柱溫在25～35℃變化范圍內，分離度均大于2.0，表明方法對柱溫耐用性強。

流速：將流速分別設定為 0.8，1.0，1.2 mL ／min，其他條件保持不變，精密量取2.1項下系統適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果流速在0.8～1.2 mL ／min 變化范圍內，分離度均大于 2.0，表明方法對流速耐用性強。

2.1 2 樣品含量測定

取6個廠家樣品，研細，按2.2項下方法制備供試品溶液，精密量取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算雜質含量。結果見表4。

表4 各廠家樣品有關物質測定結果（%）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

鹽酸黃酮哌酯極性較強，容易被洗脫，但雜質A，C，D極性較弱，不容易被洗脫。按照英國藥典及美國藥典原料測定色譜條件，結果輔料對雜質A測定有干擾。按照美國藥典片劑測定條件，輔料對雜質測定無干擾，但由于美國藥典未收載雜質D，因此在該色譜條件下雜質D很難被洗脫，保留時間約102 min。因此，參照美國藥典片劑色譜條件進行優化，采用了先等度洗脫鹽酸黃酮哌酯，再升高乙腈比例洗脫極性較弱的雜質，從而縮短了雜質保留時間并達到有效分離。USP 39原料和片劑分別采用240 nm及293 nm作為檢測波長，本研究中采用雙波長240 nm及293 nm同時檢測供試品中各雜質量及雜質個數，表明各雜質在這2個波長下響應基本一致，但293 nm基線更平穩，因此選擇293 nm作為本品有關物質檢測波長。鹽酸黃酮哌酯片6個生產企業處方采用的輔料種類較多，各不相同，所選流動相可避免輔料干擾，同時保證主峰與各雜質峰分離度達到要求。

3.2 破壞試驗

國內主要原料供應商均采用以3-甲基黃酮-8-羧酸為起始原料的合成工藝，該合成路線的主要雜質為3-甲基黃酮-8-羧酸、3-甲基黃酮-8-羧酸甲酯、3-甲基黃酮-8-羧酸乙酯。3-甲基黃酮-8-羧酸既是起始原料，也是主要降解產物，同時也是體內降解主要產物。因此，其是鹽酸黃酮哌酯的關鍵雜質，另外，3個雜質是由3-甲基黃酮-8-羧酸與甲醇或乙醇或異丙醇成酯產生，可能在原料精制工序與精制溶劑發生反應產生，也可能在制劑過程中與溶劑反應產生。鹽酸黃酮哌酯性質較穩定，原料在光照、酸、氧化、高溫、高濕等條件下均較穩定，不易降解產生雜質，但在堿性條件下易降解產生雜質A。因此，本品在生產和貯藏過程中盡量避免堿性物質的影響。

3.3 雜質譜及雜質限度確定

對檢出的主要雜質用國外藥典對照品和高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）進行了結構確認，確認檢出的主要雜質為3-甲基黃酮-8-羧酸（雜質A）、3-甲基黃酮-8-羧酸甲酯（雜質 B）和 3-甲基黃酮 -8-羧酸乙酯（雜質C），與依據原料合成過程中推論出的雜質基本一致。6個廠家107批樣品中均未檢出雜質3-甲基黃酮-8-羧酸乙酯（雜質D），破壞試驗中也均未檢出雜質D，因此建議質量標準中不控制雜質D。F廠有2批樣品雜質C含量很高，推測可能是原料或制劑生產工藝出現異常引起，具體原因有待進一步研究。考慮到目前國內生產企業質量控制是以中國藥典規定為準，因此綜合各國藥典規定和樣品檢驗結果，暫將限度定為雜質A不得超過0.5%，雜質B不得超過0.1%，雜質C不得超過0.15%，其他單個雜質不得超過0.1%，各雜質總和不得超過1.0%。

[1]張志根，孫百鳴，黃以政，等.鹽酸黃酮哌酯治療膀胱刺激癥狀[J].中華泌尿外科雜志，1996，17（10）：638.

[2]簡百錄，劉曉輝，鄧小楓，等.鹽酸黃酮哌酯治療前列腺痛的臨床觀察[J].西南國防醫學，2005，15（2）：163-164.

[3]趙德建，董其勇.鹽酸黃酮哌酯治療膀胱刺激征的臨床療效觀察[J].中國藥業，2001，10（10）：51-52.

[4]劉 濤，李 猛，陳 平，等.鹽酸黃酮哌酯在輸尿管支架術后雙“J”管綜合征中的應用[J].中國臨床研究，2013，26（10）：1061-1062.

[5]鞠富霞，王金善，張京東，等.鹽酸黃酮哌酯丙咪嗪聯合治療兒童不穩定膀胱合并遺尿癥的臨床研究[J].中國行為醫學科學，2005，14（5）：430.

[6]軒若亮，莫黨生.鹽酸黃酮哌酯加阿托品治療157例輸尿管結石性腎絞痛療效觀察[J].藥物與臨床，2005，34（4）：604.

[7]徐曉云.奧爾芬加鹽酸黃酮哌酯在輸尿管結石性腎絞痛中的治療作用[J].海南醫學院學報，2005，11（6）：530-531.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：1070-1072.

[9]王 玉，王鐵杰，張廷蘭.反相離子對高效液相色譜法測定鹽酸黃酮哌酯片的含量[J].藥物分析雜志，2002，22（3）：202-205.

[10]The United States Pharmacopieial Convention.USP39-NF34[M].Rockville：The United States Pharmacopieial Convention，2015：1693，3914-3916.

[11]British Pharmacopoeia Commission.BP 2015[M].London：The Stationery Office，2015：1692-1693.