長鏈非編碼 RNA MCM3AP-AS1對NSCLC細胞增殖、侵襲及遷移的影響*

王 亮

鄭州大學附屬洛陽中心醫院醫學檢驗科，河南洛陽 471000

肺癌目前已成為我國腫瘤死因首位，多發病于男性，其主要的致病原因與吸煙、環境等因素密切相關[1-2]。肺癌根據其病理特征和治療的方法可以分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)兩種類型，其中NSCLC占肺癌患者的 90%左右[3]。

隨著腫瘤分子生物學的發展，與肺癌相關的新型分子生物學標志物不斷問世，腫瘤的診療方法也有了新的方向。近年來，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤中的研究備受關注[4-6]。已有大量研究表明，lncRNAs 可影響許多類型腫瘤進展。lncRNA微小染色體維持蛋白3相關蛋白-反義鏈1(lncRNA MCM3AP-AS1)基因位于21號染色體上，在癌癥的進展中發揮了重要作用。有研究表明，lncRNA MCM3AP-AS1在肝癌等腫瘤中表達上調，能促進相關癌癥的惡性表型[7-10]。有研究顯示，lncRNA MCM3AP-AS1在NSCLC組織中高表達[11]，但其作用機制還存在爭議。本研究旨在探討lncRNA MCM3AP-AS1對NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要細胞 A549肺癌細胞株由實驗室保藏。

1.2主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自四季青生物有限公司；CCK8試劑購自日本同仁化學研究所； Lip2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；lncRNA MCMAP-AS1和GAPDH引物由上海生工合成；lncRNA cDNA合成試劑盒和lncRNA 熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；酶標儀購自Thermo公司；熒光定量PCR(Step one plus)儀器購自ABI 公司；熒光顯微鏡購自德國蔡司公司；離心管、培養瓶、移液管等細胞培養耗材均購自康寧公司。lncRNA MCM3AP-AS1過表達質粒和sh-MCM3AP-AS1敲低質粒及相應的陰性對照物由上海吉瑪基因合成。

1.3方法

1.3.1細胞培養、分組與轉染 將A549肺癌細胞培養于含10%FBS(鏈霉素和青霉素雙抗)的RPMI1640 培養基中，置于 37 ℃、5%CO2培養箱內培養，培養至對數生長期后進行后續一系列實驗。將A549肺癌細胞分為空白對照(Control)組、陰性對照(NC)組、過表達MCM3AP-AS1組和敲低sh-MCM3AP-AS1組。其中NC組利用空載質粒轉染A549肺癌細胞，過表達MCM3AP-AS1組利用lncRNA MCM3AP-AS1過表達質粒轉染A549肺癌細胞，sh-MCM3AP-AS1組利用sh-MCM3AP-AS1敲低質粒轉染A549肺癌細胞，按照相關Lip2000轉染試劑盒說明書進行操作；空白對照組不進行轉染處理。 轉染 48～72 h 后，收集細胞，開展后續一系列相關實驗。

1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 lncRNA MCM3AP-AS1 的表達 依據在NCBI 數據庫中查到lncRNA MCM3AP-AS1的序列設計相關引物。按TrIzol 試劑提取說明書提取各組細胞的總 RNA，反轉錄得到cDNA，以該 cDNA 為模板，根據試劑盒說明書進行qRT-PCR，每個體系設置3個重復孔，以GAPDH作為lncRNA MCM3AP-AS1的標準化內參，具體引物條件見表1。測量3次，采用 2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3CCK8細胞增殖實驗 A549 肺癌細胞分別轉染lncRNA MCM3AP-AS1過表達質粒、sh-MCM3AP-AS1敲低質粒及空載質粒48 h 后將細胞消化離心，重懸細胞并計數。將A549肺癌細胞用胰酶消化傳代，分別取對數期生長的細胞以 6 000 個/孔接種于 96 孔板中。細胞貼壁培養后，分別在 0、24、48、72 h 加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃培養箱中培養 2 h 后取出，450 nm 處記錄吸光度(A)值，每組3個復孔。比較4組間A值差異。

1.3.4細胞侵襲和遷移實驗

1.3.4.1Transwell實驗 A549肺癌細胞轉染lncRNA MCM3AP-AS1過表達質粒、sh-MCM3AP-AS1敲低質粒和空載質粒 48 h 后將細胞消化離心，重懸細胞并計數。以 8×104/200 μL 加入Transwell上室。下室中加入含有10%的胎牛血清完全培養基650 μL，放入37 ℃培養箱中培養24 h，用棉棒清掉未穿入下室的細胞，甲醇固定 30 min，0.1%的結晶紫染色30 min。蒸餾水清洗晾干后，隨機觀察5個低倍鏡視野，計數平均值，比較每組間的差異。

1.3.4.2劃痕實驗 將細胞密度為5×105個/mL的lncRNA MCM3AP-AS1過表達質粒、sh-MCM3AP-AS1敲低質粒、空載質粒以及對照組鋪在6孔板中，轉染48 h后用1 mL無菌槍頭在6孔板上“一”字劃痕，用PBS 將其清洗3遍以去除劃下的細胞，加入無血清培養基后于37 ℃培養24 h，顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結 果

2.1lncRNA MCM3AP-AS1在各轉染細胞中的表達情況 qRT-PCR測定不同轉染組A549肺癌細胞中lncRNA MCM3AP-AS1及其內參照物的相對表達水平，結果顯示：與Control組相比，NC組lncRNA MCM3AP-AS1相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；過表達MCM3AP-AS1組細胞中lncRNA MCM3AP-AS1相對表達水平為Control組的(272±1.32)倍，顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)；敲低sh-MCM3AP-AS1組肺癌細胞中lncRNA MCM3AP-AS1相對表達水平為Control組的(0.625±0.01)倍，顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2lncRNA MCM3AP-AS1對NSCLC細胞增殖的影響 CCK8細胞增殖實驗測定了不同轉染組中肺癌細胞的增殖水平，結果顯示：24 h時，與Control組相比，NC組、過表達MCM3AP-AS1組和敲低sh-MCM3AP-AS1組肺癌細胞增殖水平差異無統計學意義(P>0.05)；48 h和72 h時，NC組肺癌細胞增殖水平差異無統計學意義(P>0.05)，過表達MCM3AP-AS1組肺癌細胞增殖水平顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)，而敲低sh-MCM3AP-AS1組肺癌細胞增殖水平顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1及表2。

圖1 CCK-8細胞增殖情況

2.3lncRNA MCM3AP-AS1對NSCLC細胞侵襲、遷移的影響

表2 CCK8細胞增殖實驗結果值)

圖2 Transwell實驗肺癌細胞侵襲情況(×200)

表3 不同時間計算的各組平均細胞數目(個)

Transwell實驗測定了不同轉染A549肺癌細胞組中肺癌細胞的侵襲水平，結果如圖2和表3所示。24 h時，與Control組相比，NC組單位面積肺癌細胞侵襲數目差異無統計學意義(P>0.05)，過表達MCM3AP-AS1組單位面積肺癌細胞侵襲數目顯著增加(P<0.05)，敲低sh-MCM3AP-AS1組單位面積肺癌細胞侵襲數目顯著較少(P<0.05)。

圖3 劃痕實驗肺癌細胞遷移情況(×50)

劃痕實驗檢測了不同轉染A549肺癌細胞組中肺癌細胞的遷移水平，結果如圖3所示。24 h時，與Control組相比，NC組兩側肺癌細胞之間的距離變化不大(P>0.05)，過表達MCM3AP-AS1組兩側肺癌細胞之間的距離顯著降低(P<0.05)，敲低sh-MCM3AP-AS1組兩側肺癌細胞之間的距離顯著增加(P<0.05)。

3 討 論

近年來的研究中發現lncRNA MCM3AP-AS1在腫瘤的發生、發展中已成為研究熱點。研究表明，lncRNA MCM3AP-AS1的過表達和缺失與肝癌等腫瘤的發生、發展密切相關[7-16]。lncRNA MCM3AP-AS1 在乳腺癌中表達上調，受雌激素正向調控，并與患者的無復發生存率較差有關[17]。lncRNA MCM3AP-AS1 在彌漫性膠質瘤標本中隨著腫瘤分級的升高表達下調，與患者預后及惡性進展有顯著相關性[18]。對肺腺癌的lncRNA 生物標志物的研究中發現 lncRNA MCM3AP-AS1 在肺腺癌中與 LINC00649 存在競爭關系，具體的作用機制尚未闡明[14]。本研究發現lncRNA MCM3AP-AS1在A549肺癌細胞中表達上調，且高表達lncRNA MCM3AP-AS1能夠促進肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，低表達lncRNA MCM3AP-AS1能夠抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。lncRNA MCM3AP-AS1升高可能與肺癌的預后較差有關，表明lncRNA MCM3AP-AS1可以作為NSCLC治療中的新型生物標志物和治療靶點。

綜上所述，過表達 NSCLC 細胞中的lncRNA MCM3AP-AS1 水平可以促進NSCLC 細胞的增殖、侵襲及遷移，低表達NSCLC 細胞中的lncRNA MCM3AP-AS1 水平可以抑制NSCLC 細胞的增殖、侵襲及遷移。在將來的實驗過程中可以從以下幾個方面進一步探討lncRNA MCM3AP-AS1的致癌性：(1)收集一定數量的肺癌組織及癌旁組織，利用qRT-PCR 檢測lncRNA MCM3AP-AS1在肺癌組織、癌旁組織及不同細胞株的表達水平；(2)分析lncRNA MCM3AP-AS1差異表達與肺癌病理特征間的關系，了解 lncRNA MCM3AP-AS1對肺癌患者預后的影響(病理特征、性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移等、生存期與生存率的關系)；(3)利用流式細胞術研究 lncRNA MCM3AP-AS1的過表達和缺失對肺癌細胞凋亡的影響并且利用Western blot研究其對凋亡相關蛋白(Caspase-3、Caspase-9)表達的影響；(4)利用小鼠體內實驗(腫瘤大小、腫瘤體積、腫瘤重量、免疫組化等)進一步研究lncRNA MCM3AP-AS1 在小鼠體內的表達對肺癌的影響。