miR-124在神經系統發育、損傷及修復中作用的研究進展

楊俊娜，何麗，徐陶，許阿香，徐瑞，楊帆，曾俊偉

(遵義醫學院生理學教研室 貴州省麻醉與器官功能保護重點實驗室，貴州遵義 563000)

微小RNA (miRNA) 是一類多功能的內源性非編碼小分子RNA，長度為18～25個核苷酸序列，與靶mRNA分子的3′非翻譯區(3′-UTR)不完全性互補結合，在轉錄水平調控基因表達與蛋白合成，參與細胞增殖、分化、凋亡等生命活動過程[1]。早在2002年，Lagos-Quintana等[2]首次發現miR-124高表達于小鼠腦組織。miR-124具有三條未成熟的前體序列，分別為miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3，分別定位于染色體8p23.1、8q12.3和20q13.33[3]，Dicer酶剪切后成為成熟的miR-124序列，與下游靶基因序列結合，發揮生物學效應[4]。在大鼠、小鼠、果蠅以及非洲爪蟾等多物種組織中均有miR-124表達，其基因結構和功能在物種進化的過程中具有高度保守性。使用miRNA分子靶基因預測數據庫miRbase、Target scan和miRDB對人類miR-124靶基因進行預測并結合韋恩分析，在不同數據庫中共同預測到256個靶分子，其中NR4A1、SERP1、ROCK1等在腦發育以及神經損傷與修復中均有非常重要的作用[5～7]。提示miR-124可能與神經系統發育、損傷與修復密切相關。近年來，圍繞這一方面的研究取得了一些進展，現綜述如下。

1 miR-124在神經系統組織中的表達

在外周神經系統，miR-124表達于Corti′s器、嗅神經、背根神經節、交感神經節以及視網膜等部位[3,8]；在小鼠中樞神經系統中miR-124的表達量是肝、腎、肺、脾等器官的100倍以上。miR-124在人腦組織中表達水平較高，占成年人大腦中總miRNA的25%～48%，在大腦皮層含量最多；與大腦皮質相比，miRNA在小腦中所占的比例約為60%，在脊髓的比例約為35%[9]。其次，在海馬、枕葉、顳葉、中腦黑質、腦室下區和脊髓背角等部位miR-124表達亦較高。miR-124在腦區高水平表達提示其與神經系統的發育密切相關。形態學觀察結果顯示，小鼠內耳神經干細胞、前額葉皮質神經元、皮層星形膠質細胞、海馬神經元、脊髓的神經元和小膠質細胞、背根神經節的神經元和小鼠中腦小膠質細胞表達miR-124[10]。在離體條件下，培養的小鼠交感神經元、CX3CR1-GFP小鼠骨髓來源巨噬細胞誘導的小膠質細胞，以及肌萎縮側索硬化小鼠的脊髓和腦干部位的神經干細胞中均觀察到miR-124表達[11～13]。在BV-2小膠質細胞、SH-SY5Y細胞、U87神經膠質瘤細胞以及MN9D多巴胺神經元等細胞系也觀察到miR-124表達[14]。

2 miR-124在神經元發育過程中的作用

在小鼠胚胎腦發育過程中，miR-124表達與大腦神經元發育成熟趨勢相一致，在出生后仍然高表達。將秀麗隱桿線蟲和果蠅腦組織的神經元和星形膠質細胞共培養發現，miR-124優先表達于神經元。Baek等[15]研究發現，將miR-124轉染到HeLa細胞之后，可抑制數百種非神經元基因表達。由此初步推測，miR-124可能在神經元的發育成熟階段發揮作用，對于非神經元細胞的生長發育亦具有一定調控作用。近年研究表明，miR-124不僅可促進干細胞向神經元方向分化，而且對于神經元突起的延伸具有促進作用。

2.1 促進干細胞向神經元分化 神經干細胞(NSCs)具有增殖能力與分化能力，在神經系統發育過程中起著至關重要的作用[16]。miR-124可作用于以下下游靶點，促進多種干細胞或祖細胞向神經元方向分化：①性別決定區Y框蛋白9(SOX9)： miR-124和sox9共表達于室管膜室下區(SVZ)干細胞。在成年小鼠的腦室下區，miR-124過表達可顯著降低轉錄子SOX9表達，促進SVZ干細胞向神經元發育，而不是向星形膠質細胞發育[17]。②原肌球蛋白相關激酶B(TrkB)和細胞分裂周期蛋白42(Cdc42)：在新生C57BL/6小鼠的螺旋神經節，miR-124可促進TrkB和Cdc42表達，促進內耳神經干細胞向神經元分化，神經元特異性Ⅲ類β-微管蛋白(Tuj1)的表達在第3天開始升高，在第14天達到頂峰。相反，miR-124表達下調導致TrkB和Cdc42蛋白表達降低，神經元分化減慢，突起生長停滯[18]。③RNA聚合酶Ⅱ的C端結構域多肽的小磷酸酯酶1(SCP1)：在雞脊髓神經祖細胞，miR-124與SCP1的3′-UTR端結合，抑制SCP1表達，導致REST/SCP1信號通路受到抑制，從而解除SCP1抑制神經祖細胞向神經元分化的效應[19]；⑤特異性蛋白1(SP1)：SP1是一種轉錄因子，在調控細胞周期中具有關鍵作用。脂肪來源的間充質干細胞向神經元發育過程中，miR-124能夠與SP1結合，促進間充質干細胞向神經元分化[20]；⑥促紅細胞產生肝細胞受體B1(Ephrin B1)：miR-124能夠通過與Ephrin B1結合，降低Ephrin B1表達，促進神經干細胞向神經元分化[21]；相反，在Ephrin B1基因敲除小鼠神經干細胞向神經元分化增加。

在研究神經發育的分子機制時發現，miR-124過表達可作用于M17細胞的下游靶點Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)，顯著下調ROCK1表達，減弱其對PI3K/Akt信號通路的抑制作用，促進M17細胞向神經元分化[22]；而在P19細胞中，miR-124下游靶點有多聚嘧啶序列結合蛋白1(PTBP1)和Ⅱa類組蛋白去乙酰化酶(HDACs)。miR-124可下調PTBP1和HDACs表達，促進PTBP2以及轉錄因子MEF2C表達，靶向M6a轉錄起始位點，促進M6a表達，進而促進P19細胞向神經元分化[23]。

2.2 促進神經元突起延伸 神經元的突起不僅能夠將胞體發出的沖動通過突起傳遞給另外一個神經元，而且也是神經元接受信號的重要入口。在神經系統發育過程中，miR-124可能是通過作用于下游靶點促進了神經元突起的延伸：①HDAC5和Ras家族同源性生長相關基因(RhoG)：HDAC5可抑制C57/BL小鼠皮層神經元突觸的生長和延伸；而miR-124能下調HDAC5表達，促進神經元突觸和軸突生長[24]。在大鼠海馬神經元，RhoG活性增強，可通過ELMO/Dock180/Rac1通路抑制突觸形成與突起延伸；miR-124與RhoG的3′-UTR結合，下調RhoG表達，促進突觸形成與突起延伸[25]。②Ras家族相關蛋白Rap2a：Rap2a能夠顯著抑制神經元樹突形成。小鼠大腦神經元中，miR-124結合Rap2a的3′-UTR來抑制Rap2a表達，負性調節AKT/GSK3β信號，解除Rap2a對神經元突起生長的抑制效應，從而促進神經元突起延伸[26]。③氧甾醇結合蛋白(OSBP)：OSBP的3′-UTR存在4個保守的miR-124靶基因位點。在C57BL/6小鼠腦發育過程中，miR-124高表達引起OSBP表達下降。在N2a神經瘤母細胞，miR-124通過與OSBP結合，降低其表達，可促進N2a細胞中神經突觸的生長和延伸[27]。④cAMP反應元件結合蛋白1 (CREB1)：海兔感覺神經元和運動神經元共培養，miR-124與CREB1的3′-UTR相結合，抑制CREB1 表達；miR-124表達降低時CREB1表達上調，突觸可塑性增強[28,29]。

2.3 參與膠質細胞發育成熟 神經膠質細胞包括星形膠質細胞、少突膠質細胞、施萬細胞和衛星細胞。神經膠質細胞調節突觸的生長和興奮性，對神經系統發育有重要影響。放射狀膠質細胞轉化為星形膠質細胞是皮層發育過程中的一個重要事件，而miR-124在此過程中發揮重要作用。miR-124可與Jagged2(Jag2，Notch1的配體)結合，使Jag2表達顯著下調，進而抑制Notch1信號通路，促進皮層放射狀膠質細胞向星形膠質細胞的轉化[30]。敲除Dicer1基因小鼠大腦皮層Jag2表達增強，導致放射狀膠質細胞轉化為星形膠質細胞出現延遲，大腦皮層中易位的放射狀膠質細胞數目明顯減少。此外，miR-124在少突膠質細胞的發育以及髓鞘形成過程中也發揮了重要作用。原位雜交技術觀察顯示，miR-124通過抑制其靶基因rabgef1表達，導致包裹在軸突外側的少突膠質細胞數目減少。斑馬魚胚胎注射嗎啉后腹側后腦miR-124表達降低，神經元軸突的發育不良，尾巴形態異常彎曲[31]。

3 miR-124在神經損傷與修復過程中的作用

研究發現，小鼠大腦皮層撞擊損傷3天后，損傷區域小膠質細胞顯著活化，miR-124表達同步增加；將損傷后小鼠腦組織提取物與BV2細胞共培養，發現miR-124可促進BV2細胞向M2型極化，從而抑制神經炎癥發生。隨后研究證實，miR-124作用于靶基因PDE4B，抑制PDE4B和后續的mTOR信號通路，導致促炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α下調，而抗炎因子IL-10上調[32]。Yu等[33]檢測到腦出血小鼠腦損傷區域miR-124表達顯著降低；腦室注射miR-124模擬物后，miR-124模擬物作用于下游靶點C/EBP-α，抑制C/EBP-α表達，導致促炎性細胞因子IL-1β和TNF-α表達顯著下降，而抗炎因子IL-10表達上調，細胞凋亡減少，M2型小膠質細胞標記物Arg-1表達也顯著上調。證實miR-124能促進小膠質細胞向M2型極化，發揮抗炎作用，減輕神經系統損傷。

C57BL/6小鼠脊髓灰質損傷后周圍神經元中miR-124表達逐漸降低，損傷7天時miR-124表達為未損傷時的1/6[34]。Louw等[35]在離體實驗和在體實驗均觀察到，大鼠脊髓小膠質細胞miR-124過表達可降低骨髓來源的小膠質細胞MHC-Ⅱ表達，并可抑制TNF-α以及ROS產生。Song等[36]研究發現，miR-124a可抑制脊髓損傷大鼠吡哆醛激酶的活性，導致磷酸吡哆醛代謝紊亂，進而引起氨基酸代謝紊亂以及神經系統繼發性損傷。這些研究說明，miR-124不僅能夠特異性反映脊髓的損傷程度，且有可能成為藥物治療促進神經損傷后修復的作用靶點之一。Zhao等[34]將小鼠BMMSCs誘導分化成神經元細胞并過表達miR-124后移置入損傷脊髓的小鼠體內，小鼠脊髓損傷癥狀得到顯著緩解；轉染miR-124的大鼠NSCs經過靜脈注射進入脊髓損傷大鼠體內，同樣能促進NSCs分化成神經元和星形膠質細胞，促進脊髓損傷后的恢復。

綜上所述，miR-124作為一個重要的、多效能的miRNA，廣泛表達于外周和中樞神經系統，不僅可促進神經系統的發育成熟，而且參與神經損傷后的修復。miR-124在神經系統中表達下降往往是神經系統退行性變以及膠質瘤病變的一個重要環節。miR-124相關的信號通路機制雖已被初步被闡明或證實，但可能也有許多潛在的機制還沒被發現。對此進行深入研究將使miR-124在神經系統的發育或病變過程中的作用更加明確，也可為神經系統疾病的治療提供新思路。在神經系統發育及損傷修復過程中，miR-124表達呈動態變化，提示miR-124表達可反映神經發育或損傷或病變的程度，可能成為藥物治療的作用靶點之一。血清miR-124表達與神經系統發育或疾病關系的研究可能在未來受到重視。

參考文獻：

[1] Carthew RW,Sontheimer EJ. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs[J]. Cell,2009,136(4):642-655.

[2] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,et al. Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J]. Curr Biol,2002,12(9):735-739.

[3] Kozomara A,Griffiths-Jones S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data[J]. Nucleic Acids Res,2014(42):68-73.

[4] Meltzer PS. Cancer genomics: small RNAs with big impacts[J]. Nature,2005,435(7043):745-746.

[5] Tenga A,Beard JA,Takwi A,et al. Regulation of Nuclear Receptor Nur77 by miR-124.[J]. PLoS One,2016,11(2):148433.

[6] Mucaj V,Lee SS,Skuli N,et al. MicroRNA-124 expression counteracts pro-survival stress responses in glioblastoma.[J]. Oncogene,2015,34(17):2204-2214.

[7] Cui M,Wang J,Li Q,et al. Long non-coding RNA HOXA11-AS functions as a competing endogenous RNA to regulate ROCK1 expression by sponging miR-124-3p in osteosarcoma.[J]. Biomed Pharm,2017(92):437-444.

[8] Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V. The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell,2004,116(2):89-92.

[9] Mishima T,Mizuguchi Y,Kawahigashi Y,et al. RT-PCR-based analysis of microRNA (miR-1 and -124) expression in mouse CNS[J]. Brain Res,2007,1131(1):37-43.

[10] Weng H,Shen C,Hirokawa G,et al. Plasma miR-124 as a biomarker for cerebral infarction[J]. Biomed Res,2011,32(2):135.

[11] Akerblom M,Jakobsson J. MicroRNAs as neuronal fate determinants[J]. Neuroscientist,2014,20(3):235.

[12] Ponomarev ED,Veremeyko T,Barteneva N,et al. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-[alpha]-PU.1 pathway[J]. Nat Med,2011,17(1):64.

[13] Zhou F,Zhang C,Guan Y,et al. Screening the expression characteristics of several miRNAs in G93A-SOD1 transgenic mouse: altered expression of miRNA-124 is associated with astrocyte differentiation by targeting Sox2 and Sox[J]. J Neurochem,2017，145(1)：51-67.

[14] 盧國輝,蔣春梅,肖振勇,等. MicroRNA-124對帕金森病中多巴胺能神經元的神經保護作用[J].中華神經醫學雜志,2013,12(3):226-230.

[15] Baek D,Villen J,Shin C,et al. The impact of microRNAs on protein output[J]. Nature,2008,455(7209):64-71.

[16] Qin W,Chen S,Yang S,et al. The effect of traditional chinese medicine on neural stem cell proliferation and differentiation[J]. Aging Dis,2017,8(6):792-811.

[17] Cheng LC,Pastrana E,Tavazoie M,et al. miR-124 regulates adult neurogenesis in the SVZ stem cell niche[J]. Nat Neurosci,2009,12(4):399-408.

[18] Jiang D,Du J,Zhang X,et al. miR-124 promotes the neuronal differentiation of mouse inner ear neural stem cells[J]. Int J Mol Med,2016,38(5):1367-1376.

[19] Visvanathan J,Lee S,Lee B,et al. The microRNA miR-124 antagonizes the anti-neural REST/SCP1 pathway during embryonic CNS development[J]. Genes Dev,2007,21(7):744.

[20] Mondanizadeh M,Arefian E,Mosayebi G,et al. MicroRNA-124 regulates neuronal differentiation of mesenchymal stem cells by targeting Sp1 mRNA[J]. J Cell Biochem,2015,116(6):943-953.

[21] Arvanitis DN,Jungas T,Behar A,et al. Ephrin-B1 reverse signaling controls a posttranscriptional feedback mechanism via miR-124[J]. Mol Cell Biol,2010,30(10):2508-2517.

[22] Gu X,Meng S,Liu S,et al. miR-124 Represses ROCK1 expression to promote neurite elongation through activation of the PI3K/Akt signal pathway[J]. J Mol Neurosci,2014,52(1):156.

[23] Makeyev EV,Zhang J,Carrasco MA,et al. The MicroRNA miR-124 promotes neuronal differentiation by triggering brain-specific alternative pre-mRNA splicing[J]. Mol Cell,2007,27(3):435-448.

[24] Gu X,Fu C,Lin L,et al. miR-124 and miR-9 mediated downregulation of HDAC5 promotes neurite development through activating MEF2C-GPM6A pathway[J]. J Cell Physiol,2018,233(1):673-687.

[25] Franke K,Otto W,Johannes S,et al. miR-124-regulated RhoG reduces neuronal process complexity via ELMO/Dock180/Rac1 and Cdc42 signalling[J]. EMBO J,2012,31(13):2908-2921.

[26] Xue Q,Yu C,Wang Y,et al. miR-9 and miR-124 synergistically affect regulation of dendritic branching via the AKT/GSK3beta pathway by targeting Rap2a[J]. Sci Rep,2016,6:26781.

[27] Gu X,Li A,Liu S,et al. MicroRNA124 Regulated Neurite Elongation by Targeting OSBP[J]. Mol Neurobiol,2016,53(9):6388-6396.

[28] Wang W,Wang X,Chen L,et al. The microRNA miR-124 suppresses seizure activity and regulates CREB1 activity[J]. Expert Rev Mol Med,2016(18):4.

[29] Rajasethupathy P,Fiumara F,Sheridan R,et al. Characterization of small RNAs in Aplysia reveals a role for miR-124 in constraining synaptic plasticity through CREB[J]. Neuron,2009,63(6):803-817.

[30] Zhang C,Ge X,Liu Q,et al. MicroRNA-mediated non-cell-autonomous regulation of cortical radial glial transformation revealed by a Dicer1 knockout mouse model[J]. Glia,2015,63(5):860-876.

[31] Morris JK,Chomyk A,Song P,et al. Decrease in levels of the evolutionarily conserved microRNA miR-124 affects oligodendrocyte numbers in Zebrafish,Danio rerio[J]. Invert Neurosci,2015,15(3):4.

[32] Huang S,Ge X,Yu J,et al. Increased miR-124-3p in microglial exosomes following traumatic brain injury inhibits neuronal inflammation and contributes to neurite outgrowth via their transfer into neurons[J]. FASEB J,2018,32(1):512-528.

[33] Yu A,Zhang T,Duan H,et al. MiR-124 contributes to M2 polarization of microglia and confers brain inflammatory protection via the C/EBP-α pathway in intracerebral hemorrhage[J]. Immunology Letters,2017(182):1.

[34] Zhao Y,Zhang H,Zhang D,et al. Loss of microRNA-124 expression in neurons in the peri-lesion area in mice with spinal cord injury[J]. Neural Regen Res,2015,10(7):1147-1152.

[35] Louw AM,Kolar MK,Novikova LN,et al. Chitosan polyplex mediated delivery of miRNA-124 reduces activation of microglial cells in vitro and in rat models of spinal cord injury[J]. Nanomedicine,2016,12(3):643-653.

[36] Song JL,Zheng W,Chen W,et al. Lentivirus-mediated microRNA-124 gene-modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation promotes the repair of spinal cord injury in rats[J]. Exp Mol Med,2017,49(5):e332.