FLT3-ITD突變對急性早幼粒細胞白血病ARTA聯合ATO化療效果及預后的影響

宋玉華，喬純，肖麗嬋，李建勇，陸化

(1 南京市第二醫院，南京210003；2 南京醫科大學第一附屬醫院)

反式維甲酸(ATRA)+三氧化二砷(ATO)聯合化療是治療低、中危急性早幼粒細胞白血病的標準治療方案,但其療效個體差異較大。FMS 樣的酪氨酸激酶3(FLT3)基因屬于Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族，是存在于細胞膜上的原癌基因。FLT3突變主要發生在近膜區框架內的串聯重復,稱為FLT3內部串聯重復(FLT3-ITD)。研究發現，FLT3-ITD突變常與其他特殊的細胞遺傳學改變或基因變異有關，在伴有t(15；17)染色體異常的患者，尤其是同時伴有PML-RARα且 mRNA縮短的M3變異型者中發生率高[1～3]。FLT3-ITD 突變對早幼粒細胞白血病患者化療效果和預后的影響目前尚有爭論[4,5]。本研究探討FLT3-ITD突變對早幼粒細胞白血病患者ATRA+ATO化療效果的影響。

1 臨床資料

1.1 基本資料 選擇初治早幼粒細胞白血病患者90例，均為2010年2月～2017年3月在南京市第二醫院住院病例，男50例、女40例，年齡12～75歲、中位年齡43歲。根據臨床表現、血常規檢查、骨髓細胞形態學、白血病免疫分型、融合基因及染色體核型等明確診斷為早幼粒細胞白血病，診斷標準參照《血液病診斷及療效標準》[6]。參照急性粒細胞白血病(AML)中國診療指南采用ATRA+ATO方案化療：靜脈應用ATO 0.16 mg/(kg·d) 聯合ATRA 20 mg/(m2·d)誘導治療，至血液學完全緩解。白細胞計數>10×109/L者加去甲氧柔紅霉素(IDA)8～12 mg/(m2·d)持續3～4天或柔紅霉素(DNR)45 mg/(m2·d)持續3～4天。完全緩解后予以維持治療。

1.2 FLT3-ITD突變對早幼粒細胞白血病患者ATRA+ATO方案化療療效的影響 本研究統計學處理采用SPSS16.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率檢驗(小樣本數據)。生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統計學意義。

1.2.1 FLT3-ITD突變檢測 患者簽署知情同意書后抽取骨髓5 mL用于常規免疫表型和細胞遺傳學分析，剩余骨髓用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，采用傳統酚-氯仿抽提法提取DNA，應用紫外分光光度儀測定樣本的OD值，用去離子水稀釋DNA至50 ng/μL，- 20 ℃保存備用。FLT3-ITD突變檢測采用直接測序法。PCR擴增參照文獻[7,8]方法，針對FLT3基因外顯子14、15設計引物,由上海英俊生物技術有限公司合成，正向引物5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′；反向引物5′-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3′。反應條件：65 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，最后72 ℃延伸8 min，反應產物4 ℃保存。野生型擴增產物為329 bp處出現單一峰，ITD突變型擴增產物為在大于329 bp處出現特異性條帶。FLT3-ITD電泳及直接測序陽性標本進行PCR擴增，并送上海英俊生物技術有限公司進行克隆測序,測序結果與野生型基因序列比對。共檢出18例FLT3-ITD突變患者，檢出率為20%。

1.2.2 FLT3-ITD突變者與未突變早幼粒細胞白血病者化療效果比較 FLT3-ITD者突變與未突變者誘導治療后獲得完全緩解(CR)分別為16(88.9%)、71例(98.6%)，CR率分別為88.9%、98.6%(P>0.05)；治療過程中發生分化綜合征分別為6(33.3%)、23例(31.9%)，二者比較P>0.05。

1.2.3 FLT3-ITD突變者與未突變者化療后5年無事件生存率(EFS)和總生存率(OS)比較 FLT3-ITD突變者與未突變者化療后5年EFS分別為16.67%(3/18)、2.78%(2/72)，OS分別為16.67%(3/18)、1.39%(1/72),二者5年EFS和OS比較P均<0.05。

2 討論

FLT3基因位于染色體13q12，與其配體(FL)結合后能通過信號傳導途徑對造血干/祖細胞的增殖和分化具有重要的調節作用[6～8]。FLT3基因突變在急性髓系白血病中常見，大多數是內部串聯重復(ITD)[9]。文獻報道，早幼粒細胞白血病患者FLT3-ITD突變頻率為12%～38%，其對預后的影響目前存在爭議[1～3,10]。本研究中90例早幼粒細胞白血病患者FLT3-ITD 突變率為20%，低于歐美報道的31%～32%[11,12]，與國內報道(14.1%～23.6%)較一致[4,13,14]。本研究結果提示FLT3-ITD突變在我國早幼粒細胞白血病患者中的發生率可能低于西方國家，但也可能與病例數較少及選擇偏倚有關。

研究發現，PML-RARα融合基因在早幼粒細胞白血病發生、發展中發揮重要作用，但僅PML-RARα融合基因不足以誘發早幼粒細胞白血病[15,16]。PML-RARα融合基因引起的細胞分化能力變化可能與FLT3-ITD突變授予的增殖優勢配合導致早幼粒細胞白血病。這個致癌協作已經在小鼠模型中得到證實[17,18]。目前FLT3-ITD突變對早幼粒細胞白血病患者ATRA+ATO化療效果的影響仍有爭議。Poiré等[11]發現，FLT3-ITD突變和未突變的早幼粒細胞白血病患者化療后CR率相近；而其他研究認為，FLT3-ITD突變患者的CR率顯著低于未突變者[19,20]。本研究FLT3-ITD突變者與未突變者的CR率比較無統計學差異，與Poiré等[11]的研究結果一致。

ATRA可誘導幼稚細胞分化成熟，其最常見的并發癥是分化綜合征。分化綜合征是早幼粒細胞白血病患者早期死亡的一個重要原因，其特征是白細胞計數增加、發熱、體質量增加和體液潴留(包括肺部浸潤和胸腔積液)[21,22]。Breccia等[23]發現，以ARTA為基礎的治療方案中FLT3-ITD突變患者分化綜合征發生率較未突變者顯著升高。本研究結果顯示，FLT3-ITD突變者與未突變患者化療后分化綜合征發生率比較無統計學差異，可能與白細胞升高顯著時ATRA減量或暫時停用有關，也提示ATRA+ATO與單用ATRA相比分化綜合征發生率較低，但需要大規模對照試驗進一步證實。

早幼粒細胞白血病患者FLT3-ITD突變是除t(15;17)外常見的遺傳事件。Souza-Melo等[2]研究提示FLT3-ITD突變可能導致早幼粒細胞白血病患者可被分為不同的生物學子群，但這種突變對患者預后的影響目前不確定[24,25]。基于ATRA和蒽環霉素化療治療的研究發現，FLT3-ITD可以獨立地預測早幼粒細胞白血病患者的存活期[1,3]。有研究認為化療方案加入ATO可能消除FLT3-ITD突變導致的不良預后[26,27]；無論患者使用標準治療或鞏固方案加用ATO，FLT3突變與OS或DFS之間均無明顯關聯[11]。本研究結果顯示，FLT3-ITD突變者5年EFS及OS均明顯低于未突變者，表明早幼粒細胞白血病患者接受ATRA+ATO的化療方案后FLT3-ITD突變仍是不良預后因素。

總之，FLT3-ITD突變的早幼粒細胞白血病患者ATRA+ATO化療效果及預后相對較差；化療方案中加入FLT3-ITD抑制劑可能是其個體化治療方案，但尚需進一步研究證實。

參考文獻：

[1] Lucena-Araujo AR,Kim HT,Jacomo RH,et al. Internal tandem duplication of the FLT3 gene confers poor overall survival in patients with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid and anthracycline-based chemotherapy: an International Consortium on Acute Promyelocytic Leukemia study[J]. Ann Hematol,2014,93(12):2001-2010.

[2] Souza-Melo CP,Campos CB,Dutra P,et al. Correlation between FLT3-ITD status and clinical,cellular and molecular profiles in promyelocytic acute leukemias[J]. Leuk Res,2015,39(2):131-137.

[3] Beitinjaneh A,Jang S,Roukoz H,et al. Prognostic significance of FLT3 internal tandem duplication and tyrosine kinase domain mutations in acute promyelocytic leukemia: a systematic review[J]. Leuk Res,2010,34(7):831-836.

[4] Lou Y,Ma Y,Suo S,et al. Prognostic factors of patients with newly diagnosed acute promyelocytic leukemia treated with arsenic trioxide-based frontline therapy[J]. Leuk Res,2015,39(9):938-944.

[5] Cicconi L,Divona M,Ciardi C,et al. PML-RARα kinetics and impact of FLT3-ITD mutations in newly diagnosed acute promyelocytic leukaemiatreated with ATRA and ATO or ATRA and chemotherapy[J]. Leukemia,2016,30(10):1987-1992.

[6] 張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].3版.北京:科學出版社,2007:106-116.

[7] 張蘇江,李建勇,施靜藝.急性髓系白血病FLT3基因突變的研究[J].中華血液學雜志,2007,28(2):124-126.

[8] 韓陽利,張蘇江,喬純,等.急性髓系白血病FLT3基因突變研究[J].中華實驗血液學雜志,2009,17(5):1135-1139.

[9] Sanz MA,Lo Coco F,Martin G,et al. Definition of relapse risk and role of nonanthracycline drugs for consolidation in patients with acute promyelocytic leukemia: a joint study of the PETHEMA and GIMEMA cooperative groups[J]. Blood,2000,96(4):1247-1253.

[10] Barragán E,Montesinos P,Camos M,et al. Prognostic value of FLT3 mutations in patients with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid and anthracycline monochemotherapy[J]. Haematologica,2011,96(10):1470-1477.

[11] Poire′ X,Moser BK,Gallagher RE,et al. Arsenic trioxide in front-line therapy of acute promyelocytic leukemia (C9710): prognostic significance of FLT3 mutations and complex karyotype[J]. Leuk Lymphoma,2014,55(7):1523-1532.

[12] Gale RE,Hills R,Pizzey AR,et al. Relationship between FLT3 mutation status,biologic characteristics,and response to targeted therapy in acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,2005,106(12):3768-3776.

[13] 宮本法,王迎,林冬,等.急性早幼粒細胞白血病FLT3-ITD突變分析[J].中國實驗血液學雜志,2016,24(6):1615-1621.

[14] 許惠麗.FLT3基因突變在急性早幼粒細胞白血病中的臨床意義[J].中國現代藥物應用,2016,10(8):27-28.

[15] Westervelt P,Ley TJ. Seed versus soil: the importance of the target cell for transgenic models of human leukemias[J]. Blood,1999,93(7):2143-2148.

[16] Grimwade D,Enver T. Acute promyelocytic leukemia: where does it stem from[J]. Leukemia,2004(18):375-384.

[17] Kelly L,Kutok J,Williams I,et al. PML/RARalpha and FLT3-ITD induce an APL-like disease in a mouse model[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(12):8283-8288.

[18] Le Beau MM,Davis EM,Patel B,et al. Recurring chromosomal abnormalities in leukemia in PML-RARA transgenic mice identify cooperating events and genetic pathways to acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,2003,102(3):1072-1074.

[19] Hong SD,Kim YK,Kim HN,et al. Treatment outcome of all-trans retinoic acid/anthracycline combination chemotherapy and the prognostic impact of FLT3/ITD mutation in acute promyelocytic leukemia patients[J]. Korean J Hematol,2011,46(1):24-30.

[20] Kutny MA,Moser BK,Laumann K,et al. FLT3 mutation status is a predictor of early death in pediatric acute promyelocytic leukemia: a report from Children′s Oncology Group[J]. Pediatr Blood Cancer,2012(59):662-667.

[21] Montesinos P,Bergua JM,Vellenga E,et al. Differentiation syndrome in patients with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid and anthracycline chemotherapy: characteristics,outcome,and prognostic factors[J].Blood,2009,113(4):775-783.

[22] Jeddi R,Ghédira H,Mnif S,et al. High body mass index is an independent predictor of differentiation syndrome in patients with acute promyelocytic leukemia[J]. Leuk Res,2010,34(4):545-547.

[23] Breccia M,Loglisci G,Loglisci MG,et al. FLT3-ITD confers poor prognosis in patients with acute promyelocytic leukemia treated with AIDA protocols: long-term follow-up analysis[J]. Haematologica,2013,98(12):e161-e163.

[24] Gale RE,Hills R,Pizzey A,et al. Relationship between FLT3 mutation status,biologic characteristics,and response to targeted therapy in acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,2005,106(12):3768-3778.

[25] Molica M,Breccia M. FLT3-ITD in acute promyelocytic leukemia: clinical distinct profile but still controversial prognosis[J]. Leuk Res,2015,39(4):397-399.

[26] Shen Y,Fu YK,Zhu YM,et al. Mutations of epigenetic modifier genes as a poor prognostic factor in acute promyelocytic leukemia under treatment with all-trans retinoic acid and arsenic trioxide[J]. E Bio Med,2015,2(6):563-571.

[27] Hu J,Liu YF,Wu CF,et al. Long-term efficacy and safety of all-trans retinoic acid/arsenic trioxide-based therapy in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(9):3342-3347.