貴陽地區胃部疾病患兒HP耐藥性及其23S rRNA基因突變特征分析

熊妍，朱莉，吳芳草，陳芳，郭長城，楊凈，劉芳，陳崢宏

(1貴陽市兒童醫院，貴陽550002；2貴州醫科大學微生物教研室)

幽門螺桿菌(HP)是一種微需氧、弧形或螺旋狀的革蘭陰性菌，定植于人的胃黏膜，是引起慢性胃炎、十二指腸潰瘍等上消化道疾病的重要病原體，而且與胃癌、胃黏膜相關性淋巴樣淋巴瘤等發生、發展有密切關系[1,2]。HP感染通常開始于兒童時期，在兒童時期根除HP有助于降低胃腸道疾病甚至胃癌的發病率[1,3]。目前國內外兒童HP根除率在63.9%～93.0%，不能完全根除HP的主要原因是HP耐藥。研究證實，HP克拉霉素耐藥與23S rRNA基因V區上的點突變有關，此位點突變的發生率有明顯地區差異[4]。本研究觀察了貴陽地區胃部疾病患兒HP耐藥性及其23S rRNA基因V區突變情況，旨在為根除HP治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2015年8月～2017年6月因消化道癥狀于貴陽市兒童醫院就診的患兒561例，男304例、女257例，年齡11個月～15歲；主要癥狀為惡心、腹痛、嘔吐、腹脹、燒心、反酸、消化道出血等?；純壕驮\前未進行根除HP治療，入院后均行胃鏡檢查。本研究已獲得貴陽市兒童醫院醫學倫理委員會批準，患兒家長均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 胃黏膜組織HP分離、培養和鑒定 胃鏡檢查過程中用無菌活檢鉗夾取患兒胃竇部黏膜1塊，迅速置于HP尿素酶試紙上，試紙組織邊緣1 min內由黃色變為櫻紅色為強陽性，3 min內變成櫻紅色為弱陽性，不變色為陰性。取HP尿素酶試紙檢測結果為強陽性或者弱陽性的新鮮胃黏膜組織，用無菌研磨器研磨成組織懸液，取100 μL接種于10%哥倫比亞血瓊脂平板上，置于厭氧罐內，放置微需氧產氣袋后密封厭氧罐，置于37 ℃培養箱培養。5～7天后挑取瓊脂平板上透明針尖樣可疑菌落，經革蘭染色初步鑒定后，挑取單菌落傳代培養，取培養物進行革蘭染色、氧化酶試驗、脲酶試驗和觸酶試驗，均陽性者鑒定為HP。561例患兒共分離出HP 49株。

1.3 HP菌株耐藥性檢測 采用E-test藥敏試驗。對用界值法檢測判為耐藥的菌株再用E-test法檢測MIC值。用1 000 μL移液器取100 μL HP懸液，置于直徑75 mm的平板上，然后用L形玻璃涂布棒把HP懸液均勻涂布在平板上，放置10 min，將抗生素E-test試條貼在MH血瓊脂表面，37 ℃、微需氧培養，培養時間為72 h。橢圓形抑菌環和E-test試條的交界點藥物濃度值就是所需的MIC值。耐藥判斷標準：甲硝唑MIC高于32 μg/mL、四環素MIC高于16 μg/mL、克拉霉素MIC高于1 μg/mL、左氧氟沙星MIC高于1 μg/mL、阿莫西林MIC高于1 μg/mL。以敏感HP菌株NCTC11637進行質控。

1.4 克拉霉素耐藥HP菌株23S rRNA基因V區突變情況檢測 采用直接測序法。采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，根據試劑盒說明書操作提取HP菌株的DNA，- 20 ℃保存備用。采用PCR法檢測。引物由Primer blast 設計，正向引物：5′-TGGCGTAACGAGATGGGAGCTGT-3′，反向引物：5′-AGTCTTTGTGCGAGCTTAGGGA-3′。PCR擴增條件：94 ℃預變性、5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈照射下在800 bp處見電泳條帶。PCR產物送生工生物工程(上海)有限公司進行雙向測序。采用CLC Free Workbench4.5.1軟件對HP菌株測序結果與GenBank中收錄的HP敏感菌株U27270的23S rRNA基因序列進行比對。

2 結果

2.1 HP菌株耐藥情況 藥敏試驗結果顯示，49株HP菌株對阿莫西林耐藥8株(16.3%)，對甲硝唑耐藥24株(49.0%)，對克拉霉素耐藥18株(36.7%)，對左氧氟沙星耐藥13株(26.5%)，對四環素耐藥7株(14.3%)。此外，還存在聯合耐藥菌株，其中對阿莫西林與克拉霉素聯合用藥的耐藥率為11.1%(1/49)，對阿莫西林與甲硝唑聯合用藥的耐藥率為8.2%(4/49)，對阿莫西林與左氧氟沙星聯合用藥的耐藥率為4.1%(2/49)，對阿莫西林與四環素聯合用藥的耐藥率為0。分離出的7株四環素耐藥菌株均同時對克拉霉素耐藥。

2.2 克拉霉素耐藥HP菌株23S rRNA基因V區突變情況 18株克拉霉素耐藥HP菌株23S rRNA V 區存在點突變，突變位點包括A2144G(4/18)、T2183C(15/18)、C2196T(1/18)、A2224G(1/18)、T2245C(18/18)、T2277C(1/18)、A2303G(2/18)、T2321C(1/18)、C2423T(1/18)、G2309A(1/18)、C2750T(1/18)、C2760T(1/18)、T2712C(1/18)、C2695A(1/18)。

3 討論

近年來，HP根除率不斷下降，甚至已低于80%，導致這一現象的主要原因是耐藥[5]?？死顾厥桥R床最常用的根除HP的藥物之一，HP克拉霉素耐藥率在不同國家和地區有一定差異，在一些發達地區耐藥率較高[6]。歐洲一項多中心研究表明，兒童HP克拉霉素的耐藥率從1990～1995 年的6.2%上升至2007～ 2009年的19.4%[7]。歐洲Maastricht-Ⅳ 共識會議提出 ，HP克拉霉素耐藥率超過20%時臨床需根據藥敏試驗結果選擇治療藥物[8]。本研究HP克拉霉素耐藥率為36.7%，提示對這類兒童行HP根除治療時應行藥物敏感試驗。HP對甲硝唑耐藥是目前全球性問題,嚴重影響HP根除率。甲硝唑高耐藥率發生的主要原因為甲硝唑在大多數感染中被普遍使用；藥物使用劑量不正確；藥物本身的藥理作用和不良反應。胡華建等[9]報道，浙江兒童HP甲硝唑耐藥率達51.8%。本研究為49%，處于較高水平，與以上結果有一致性。阿莫西林是β-內酰胺類抗生素，清除HP效果較好，臨床應用較多[10]。以往研究對HP行耐藥性檢測時并沒有檢測到β-內酰胺酶活性，說明HP菌株對阿莫西林耐藥的產生與β-內酰胺酶的關系不大[11]。本研究阿莫西林的耐藥率為16.3%，與本地區成人相近[12]，耐藥率也偏高；需引起臨床重視。左氧氟沙星屬于喹諾酮類抗生素，本研究左氧氟沙星耐藥率為26.5%，高于一般水平。可能與樣本量較小有關，亦可能與左氧氟沙星在其他疾病中廣泛應用有關，需擴大樣本量進一步觀察。四環素是一類治療HP感染價格較為偏宜的藥物。2000年巴西HP四環素耐藥率為7%。由于我國使用四環素類藥物行抗菌治療的時間較長，故HP耐藥率明顯高于其他國家，已達到58.8%，MIC小于16 mg/L[13，14]。本研究HP對四環素的耐藥率為14.3%，明顯低于成人，可能與其近20年來四環素未在兒童中使用有關。目前兒科根除HP的主要藥物為克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑?？死顾厥且痪€藥物，但隨著耐藥菌株的出現，兒童HP感染根除率降低。HP對克拉霉素產生耐藥的機制為HP菌的23S rRNA基因V區上發生點突變，導致核糖體的構象發生改變，使克拉霉素結合位點也隨之改變，進而導致HP與克拉霉素的親合力降低，藥物不能有效阻止細菌蛋白合成[15]。目前不同國家和地區HP克拉霉素耐藥率均呈逐年上升趨勢。國內相關文獻報道，國內HP克拉霉素耐藥率較高，且逐年上升[16]。而伊朗、埃及開羅的HP克拉霉素耐藥率分別為33.7%、57.7%[17,18]。本研究為36.7%。分析以上數據，HP對克拉霉素耐藥率較高，在選用含克拉霉素的三聯療法作為行根除HP治療時需了解菌株的藥物敏感性。

研究證實，HP菌株23S rRNA基因V區點突變與克拉霉素耐藥有關，最普遍的突變位點為A2143G(A2143C)和A2142G。本研究結果所測菌株中普遍存在T2183C、T2245C突變，突變率分別為85.2%和100%。C2214T位點只在1株山西HP耐藥菌株中發現[19]；2株HP質控菌株NCTC11637和SS1在T2245C、T2321C、T2712C均發生突變，以上突變位點與HP克拉霉素耐藥并無明顯關系。本研究A2144G突變率為22%，無法確定A2144G是否與克拉霉素耐藥有關，需要進一步加大樣本量分析。突變位點A2303G、G2309A、G2305A、C2423T、C2750T、C2760T、C2769A國內外相關文獻未見報道，其中G2305A在9株敏感菌株檢測到1株，C2760T在18株耐藥菌株和9株敏感菌株分別檢測到2株和3株，在耐藥菌株中C2423T、A2303G、G2309A、C2750T、C2769A均僅檢測到1株，以上這些突變位點是否與HP克拉霉素耐藥性有關，還需加大樣本量進一步研究。本研究結果提示，貴陽地區胃部疾病患兒HP菌株23S rRNA基因V區堿基分布具有較為復雜的多態性。

綜上所述，貴陽地區胃部疾病患兒HP對克拉霉素、甲硝唑的耐藥率較高，對阿莫西林和四環素耐藥性較低。克拉霉素耐藥HP菌株23S rRNA基因V區存在點突變，最常見的突變位點是T2183C。

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