香煙煙霧暴露對正常小鼠下呼吸道菌群分布的影響

黨如意，趙晨陽，樊興，趙子龍，蔣新格，李革

(重慶醫科大學，重慶400016)

吸煙是目前公認的慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌的首要致病危險因素。但香煙煙霧的致病機制尚不十分清楚，且鮮見從微生物角度研究吸煙導致肺部疾病的機制。香煙煙霧中的主要致癌成分之一是多環芳香化合物[1]。研究發現，肺癌患者吸入富含多環芳烴煙霧者相比于吸入含少量多環芳烴煙霧者，下呼吸道菌群操作分類單位(OTU)數值減少，即細菌物種數減少[2]。研究發現，健康人群中吸煙者咽部細菌檢出率高于非吸煙者[3]。煙草本身含有一些病原體，包括多種細菌和真菌等[4]。以上事實均提示香煙煙霧暴露對下呼吸道菌群分布有一定影響。目前關于香煙煙霧暴露對下呼吸道菌群分布影響的研究多為臨床研究[1，5,6]，樣本量較少，混雜因素不容易控制，更重要的是獲取下呼吸道菌群的方法不完善。故多數研究結果可信度不高。2016年10月～2017年3月，本研究觀察了香煙煙霧暴露對正常小鼠下呼吸道菌群分布的影響。現分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性昆明系小鼠10只，SPF級，體質量20～22 g，購自重慶醫科大學實驗動物中心。五牛牌香煙。染毒缸(圓柱體，底直徑70 cm，高80 cm)、海利超靜強力氣泵(型號V10，功率10 W，壓力>0.02 MPa，排氣量10 L/min)、高壓蒸汽滅菌鍋、研缽、剪刀、鑷子。

1.2 小鼠分組及香煙煙霧暴露 將10只小鼠隨機分為實驗組和對照組各5只。實驗組每天進行1次、每次2 h的香煙煙霧暴露。暴露方式：小鼠置于染毒柜中，一次性點燃5支香煙，使染毒柜內迅速達到較高的煙霧濃度，然后每隔半小時點3支香煙，整個染毒過程持續2 h。微型真空泵持續將外界空氣泵入染毒缸保證小鼠不出現死亡。肉眼可見容器內充滿大量白色煙霧。暴露持續70天。對照組不做處理，自由進食飲水。

1.3 下呼吸道菌群分布檢測 停止煙霧暴露15天將10只小鼠斷頸處死，用剪刀和鑷子取出小鼠肺部，置于研缽中，加入少量蒸餾水研磨至無明顯肉眼可見組織，置于-20 ℃冰箱保存。標本送凌恩公司采用Illumina Miseq平臺行16S rRNA Ⅴ3～Ⅴ4區測序。主要步驟包括基因組DNA提取、設計并合成引物、PCR擴增和產物純化、PCR產物定量和均一化、MiSeq PE文庫制備、MiSeq高通量測序。檢測兩組下呼吸道菌群組成并測算各組分相對豐度。相對豐度即該菌群豐度占總菌群豐度的比例。相對豐度大于1%即為優勢菌屬。

1.4 兩組下呼吸道菌群分布分析

1.4.1 α多樣性分析 應用Mothur軟件(http://www.mothur.org/)中的summary.single命令，計算4種常用的生物多樣性指數：Chao、Simpson、Shannon和Coverage指數。Simpson指數常用來描述一個區域的生物多樣性，Simpson指數越大，說明群落多樣性越低。Chao、Shannon指數是用不同算法估計樣本中所含OTU數目的指數，在生態學中常用來估計物種總數。Coverage指數是指各樣本文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低。該指數反映本次測序結果是否代表樣本中微生物的真實情況。

1.4.2 稀釋曲線分析 稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定數量的個體，統計這些個體所代表的物種數目，并以個體數和物種數來構建曲線。它既可用來比較測序數據量不同樣本中物種的豐富度，也可用來說明樣本的測序數據量是否合理。根據獲得的OTU數據，以測序樣本的序列數為橫坐標，得到的OUT數值作為縱坐標，繪出每個樣本的稀釋曲線，當曲線趨于平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。稀釋曲線可反映樣本的測序深度。

1.4.3 物種豐度差異分析 采用LEFSe軟件根據分類學組成對樣品按照不同的分組條件進行線性判別分析，找出對樣品劃分產生顯著性影響的群落或物種。此次研究在界、門、綱、目、科、屬這6個層次上對同類的OTU進行聚類，通過LEFSe檢測,可在進化分枝樹圖上展示在各個層次水平中有組間差異的微生物群落或者物種。統計在兩組中豐度有差異且LDA值大于2的菌群。應用軟件MEGAN4(http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan/)生成物種進化樹及豐度信息。

1.4.4 PCA分析 即主成分分析。通過分析不同樣本OTU組成找到數據中最主要的元素和結構。

1.5 統計學方法 兩組生物多樣性指數比較采用單因素方差分析，兩組同屬細菌物種豐度差異分析使用Metastats分析法[7]。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組下呼吸道主要菌屬及其相對豐度 對照組下呼吸道主要菌屬按相對豐度從高到低依次為鹽單胞菌(相對豐度70.8%)、Enterobacteriaceae_unclassified(相對豐度2.5%)、腸桿菌(相對豐度2.3%)、Pelagibacterium(相對豐度2.1%)、涅斯捷連科氏菌(相對豐度1.8%)、葡萄球菌(相對豐度1.4%)、芽孢桿菌(相對豐度1.2%)、Gemmatimonadaceae_uncultured(相對豐度1.1%)、副球菌(相對豐度0.8%)、紅桿菌(相對豐度0.7%)、棒狀桿菌(相對豐度0.6%)、Saccharibacteria_norank(相對豐度0.4%)、Zoogloea(相對豐度0.4%)，實驗組上述菌屬相對豐度分別為46.8%、2.9%、2.5%、3.9%、0.9%、0.4%、0.3%、1.0%、19.3%、1.5%、1.5%、1.4%、1.2%。兩組優勢細菌十分相似。最主要的菌屬均為鹽單胞菌屬，雖然菌屬相對豐度差異較大，但經Metastats分析差異無統計學意義。兩組棒狀桿菌屬差異也較大，主要是由于實驗組有一只小鼠棒狀桿菌屬相對豐度為85.9%，這可能是受環境影響所致。

2.2 兩組下呼吸道菌群的α多樣性 實驗組、對照組Chao指數分別為603±77、388±67，兩組比較P>0.05。實驗組與對照組Shannon指數分別為2.29±1.03、1.82±1.23，Simpson指數分別為0.40±0.21、0.53±0.28，兩組比較P均>0.05。兩組Coverage指數為0.990～0.999。

2.3 兩組下呼吸道菌群的稀釋曲線 雖然樣本序列增大，但OTU變化不大。

2.4 兩組下呼吸道菌群物種豐度的差異性 兩組物種豐度有差異且LDA值大于2的菌群包括Lactobacillales目、Streptococcaceae科、Negativicutes綱、Selenomonadales科、Streptococcus屬、Enterococcaceae科、Enterococcus屬、Nordella屬、CandidatusAccumulibacter屬、Ilumatobacter屬。Metastats軟件分析發現，在屬的水平上，兩組共16種菌屬的物種相對豐度存在統計學差異。但存在差異的菌群相對豐度均小于1%。其常見的致病菌Enterococcus(腸球菌)豐度與相對豐度均有輕度上升。

2.5 兩組下呼吸道菌群PCA分析 對照組菌群組成較為相似，實驗組則差異明顯。

3 討論

研究表明，生活在人體中的細菌數量大約為人體細胞數量的10倍[8]。下呼吸道菌群與肺部疾病之間的關系是目前臨床研究的熱點之一。目前已經在吸煙者和不吸煙者的肺組織和支氣管灌洗液中均發現了細菌群落[5]。而且還發現下呼吸道菌群與COPD、肺癌、哮喘和囊性纖維化密切相關[2，5,9]。盡管在人體內生長著大量細菌，但是憑借現在的技術，其中70%以上的細菌并不能被培養，20%～30%的細菌難以培養[10]。所以使用傳統細菌培養的辦法對下呼吸道菌群分布進行研究，結果并不可靠。本研究應用基于PCR擴增技術的16S rRNA基因測序技術和Illumina Misep高通量測序平臺，基本完全覆蓋特定可變區，準確地獲得微生物群落多樣性的信息，測序原理精確、數據準確性高，用于研究復雜樣本的微生物群落的組成，具有先進性[11]。

本研究結果顯示，兩組下呼吸道菌群Shannon、Chao、Simpson指數比較均無統計學差異，說明短時間(70天)、大劑量(14支)香煙煙霧暴露對小鼠下呼吸道菌群多樣性和物種豐度并無明顯影響。因小鼠下呼吸道菌群較穩定，故此結論比較可靠。通過PCA分析發現，對照組菌群組成較為相似，實驗組菌群組成則差異明顯。這表明香煙煙霧影響了菌群組成。通過Metastats分析發現，兩組有16種菌屬相對豐度存在差異，但相對豐度均不足1%。表明香煙煙霧暴露對小鼠下呼吸道菌群結構有一定影響，但影響有限。非優勢菌屬相對豐度少，在不同個體之間差異較大，且此次研究樣本量較少，所以此次研究只能提示煙霧暴露對于少量菌群存在影響，但是否是上述菌群還需進一步擴大樣本量觀察。

盡管目前并未有研究表明香煙煙霧對下呼吸道菌群多樣性有影響。但我們認為并不能認定香煙煙霧對下呼吸道菌群多樣性無影響。因為健康人吸煙者與非吸煙者下呼吸道菌群多樣性之所以相似，可能只是因為吸煙時間短和吸煙量少。同樣，本次研究可能由于染毒時間有限而導致結果差異不大。本研究還發現，小鼠下呼吸道有著較豐富的菌群。正常小鼠下呼吸道菌群中數量在前三的菌屬為鹽單胞菌、Enterobacteriaceae_Unclassified、腸桿菌，相對豐度依次為70.8%、2.5%、2.3%。這為今后的研究積累了資料。

高通量16S rRNA測序技術相對于傳統細菌培養技術可更準確全面地識別細菌，但卻不能區分有活力的細菌和死亡的細菌。所以16sRNA測序技術與傳統細菌培養技術在檢測下呼吸道菌群分布方面應該是相輔相成的，而不是前者替代后者的關系。本次研究表明，香煙煙霧可使腸球菌的豐度和相對豐度均輕度上升。腸球菌是分布在人和動物的口腔和腸道的正常菌群，可導致院內獲得性肺炎。腸球菌的毒力因子包括膠原蛋白黏附素、聚集物質、溶血素、絲氨酸蛋白酶。這些毒力因子可幫助腸球菌破壞宿主細胞并引起宿主免疫反應[12]。通過PCA分析發現，對照組菌群組成更加相似，實驗組菌群組成差異明顯。這表明香煙煙霧打破了原有正常菌群與宿主的平衡。提示香煙煙霧可輕微改變菌群，可能引起宿主的免疫反應改變[13],但具體引起宿主何種免疫反應的改變尚待進一步研究。鑒于宿主免疫反應異常是促進COPD病情進展的重要原因[14]，故推測香煙煙霧可能通過增加致病菌的生長繁殖速度和改變下呼吸道菌群整體組成，引起宿主下呼吸道免疫反應改變，從而導致或者促進肺部疾病的發生。

參考文獻：

[1] 周閏.香煙煙霧對室內空氣污染及其對于健康影響的研究進展[J].職業與健康，2014，30(16)：2346-2348.

[2] Hosgood HD 3rd,Sapkota AR,Rothman N,et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures[J]. Environ Mol Mutagan，2014，55(8)：643-651.

[3] 陳麗萍.吸煙對人體呼吸道菌群的影響[J].中國微生態學雜志，2013，25(1)：29-33.

[4] Sapkota AR,Berger S. Human pathogens abundant in the bacterial metagenome of cigarettes[J]. Environmental Health Perspect，2010，118(3)：351-356.

[5] Erb-Downward JR,Thompson DL,Han MK. Analysis of the lung microbiome in the "healthy" smoker and in COPD[J]. PLoS One，2011，6(2)：e16384.

[6] Sze MA,Dimitriu PA,Hayashi S. The lung tissue microbiome in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med，2012，185(10)：1073-1080.

[7] White JR,Nagarajan N,Pop M. Statistical methods for detecting differentially abundant features in clinical metagenomic samples[J]. PLoS Comput Biol，2009，5(4)：e1000352.

[8] Ley RE,Peterson DA,Goedon JI. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine[J]. Cell，2006,124(4)：837-848.

[9] Huang YJ,Nariya S,Harris JM. The airway microbiome in patients with severe asthma; association with disease features and severity[J]. J Allergy Clin Immunol，2015,136(4)：874-884.

[10] Sibley CD,Grinwis ME,Field TR. Culture enriched molecular profiling of the cystic fibrosis away microbiome[J]. PLoS One，2011，6(7):e22702.

[11] Frey KG,Herrera-Galeano JE,Redden CL,et al. Comparison of three next generation sequencing platforms for metag-enomic sequencing and identification of pathogens in blood[J]. BMC Genomics，2014，15(96)：1186.

[12] 呂娜，高原.糞腸球菌致病因子的研究進展[J].內蒙古民族大學學報，2015，30(4)：323-326.

[13] Dickson RP,Erb-Downward JR,Martinez FJ,et al. The microbiome and the respiratory tract [J]. Annu Rev Physioc,2016(78)：481-504.

[14] MacNee W,Tuder RM. New paradigms in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease Ⅰ[J]. Proc Am Thorac Soc,2009,6(6):527-531.