PCR-RFLP技術與結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術對HBV拉米夫定耐藥基因檢測效果分析

卜范峰，朱曉艷，彭德志，王睿，田欣欣，王燕，周永坤

(1 濟南金域醫學檢驗中心，濟南250101；2 山東省疾病預防控制中心；3 山東中醫藥大學附屬醫院)

拉米夫定為核苷類似物，是治療慢性乙肝的常用藥物，但治療6個月以上易出現耐藥[1]。DNA聚合酶基因突變是導致HBV耐藥的主要原因。其基因突變主要在204位點的YMDD基序，即酪氨酸(Y)-蛋氨酸(M)-天門冬氨酸(D)-天門冬氨酸(D)中的M分別被纈氨酸(V)、異亮氨酸(I)或色氨酸(S)取代，生成YVDD、YIDD或YSDD；此外，還可出現與180位點的聯合突變，180位點的M被亮氨酸(L)取代，生成L180M[2]。目前常用的基因突變檢測方法有DNA測序法、寡核苷酸芯片法、實時定量PCR TaqMan探針法等，但均存在不同程度缺陷，如操作繁瑣、檢測費用高、技術條件要求高等[3]，且均難以檢測出混合突變樣本。PCR-限制性片斷長度多態性(PCR-RFLP)技術和結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術檢測費用低、操作簡單，可彌補以上方法的不足。本研究分析PCR-RFLP技術與結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術檢測HBV DNA聚合酶基因突變結果，旨在為乙肝患者拉米夫定耐藥基因檢測提供易于操作且價格低廉的快速、可批量檢測方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1～6月濟南金域醫學檢驗中心收集的乙肝血清標本186例份。標本來源患者經臨床和實驗室檢查明確診斷，除用拉米夫定治療外，未用其他抗病毒藥物治療。其中，接受拉米夫定治療≥6個月者162例、<6個月者19例，未進行任何治療者5例。

1.2 拉米夫定耐藥HBV DNA聚合酶基因突變檢測

1.2.1 PCR-RFLP技術 采用聚乙二醇沉淀法[4]提取各血清樣本HBV DNA，以提取的HBV DNA為模板進行PCR擴增。參照文獻[5]利用Primer Premier5.0軟件設計相關引物，并由深圳華大基因股份有限公司合成。引物序列：上游引物F1：5′-CACTGTTTGGCTTTCAGTCAT-3′、F3： 5′-GTGGGCCTCAG-TCCGTTTCTC-3′、S1：5′-CACTGTCTGGCTTTCAGCT-AT-3′，通用下游引物B2：5′-GTTCAAATGTATACCC-AAAG-3′。其中，引物F1和B2用于檢測204位點基因突變，引物S1和B2用于檢測204位點YSDD基序突變，引物F3和B2用于檢測180位點基因突變。PCR反應體系共50 μL：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，5 μmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μL Hot-Start Taq酶0.6 μL，HBV DNA 2 μL，ddH2O 32.4 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、46 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40個循環，最后72 ℃延伸5 min。取PCR產物8 μL，分別用限制性內切酶NdeⅠ、SfcⅠ或NIaⅢ水解，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束，在Alpha ImageTM2200 system成像儀上觀察酶切結果并拍照。結果判斷：HBV DNA經引物F1和B2擴增后的電泳產物用限制性內切酶NdeⅠ酶切，可被NdeⅠ酶完全切開，即為野生型，酶切后片段大小分別為99、20 bp；可被NdeⅠ酶不完全切開，即為野生與突變混合型；不能被NdeⅠ酶切開，即為突變型。突變型樣本可被限制性內切酶NIaⅢ酶進一步切開，即為YVDD突變型，酶切后片段大小分別為97、22 bp；不能被NIaⅢ酶切開，即為YIDD突變型或YSDD突變型。不能被限制性內切酶NIaⅢ酶切開的樣本再用引物S1/B2擴增，其產物用限制性內切酶SfcⅠ酶切，可被SfcⅠ酶切開，即為YSDD突變，酶切后片段大小分別為15、105 bp；不能被SfcⅠ酶切開，即為YIDD突變。HBV DNA經引物F3/B2擴增后的電泳產物用限制性內切酶NIaⅢ酶切，可被NIaⅢ酶切開，即為L180M突變型，酶切后片段大小分別為24、167 bp；不能被NIaⅢ酶切開，即為野生型[6]。

1.2.2 結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術 采用聚乙二醇沉淀法[4]提取各血清樣本HBV DNA，以提取的HBV DNA為模板進行PCR擴增。所需引物由Primer Premier5.0軟件設計，由深圳華大基因股份有限公司合成。引物序列：通用上游引物335u：5′-TCACCAACCTCTTGTCCTCC-3′，下游引物YMDD-L：5′-CCCAATACCACATCATCCAT-3′；YIDD-L：5′-CCCCAATACCACATCATCA-3′；YVD-D-L：5′-CCCAATACCACATCATCCAC-3′；YSDD-L：5′-CCCAATACCACATCATCACT-3′；Control C：5′-CC-CCCAATACCACATCATC-3′；667M：5′-GCACTAGTAAACTGAGCCAT-3′；667W：5′-GCACTAGTAAACTGAGCCAG-3′。其中，上游引物335u和下游引物YMDD-L、YIDD-L、YVDD-L、YSDD-L用于檢測204位點基因突變，設其反應分別為反應M、I、V、S；上游引物335u和下游引物667W、667M用于檢測180位點基因突變；上游引物335u和下游引物Control C作為陽性對照(即反應C)。PCR反應體系共20 μL：10×PCR buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，400 nmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μL Hot Start Taq酶0.2 μL，1×SYBR Green Ⅰ1 μL，10 nmol/L熒光素校準染料1 μL，HBV DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL。反應條件：95 ℃活化Hot Start Taq酶10 min，95 ℃預變性30 s，68～40 ℃退火30 s[7](每個循環降低0.7 ℃)共40個循環，最后72 ℃延伸30 s。記錄每個反應管內熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數，即Ct值。結果判斷：在180位點基因突變檢測中，為便于描述，將引物對335u/667M的擴增反應稱為反應1，引物對335u/667W的擴增反應稱為反應2。反應1用于擴增突變型HBV DNA，反應2用于擴增所有HBV DNA為對照反應。當ΔCt≥4(ΔCt=反應2的Ct值-反應1的Ct值)時，表明被檢測樣本含有180位點基因突變；當ΔCt<4(ΔCt=反應2的Ct值-反應1的Ct值)時，表明被檢測樣本180位點存在突變型和野生型；當ΔCt>4(ΔCt=反應1的Ct值-反應2的Ct值)時，表明被檢測樣本180位點不存在基因突變。在204位點基因突變檢測中，反應M、I、V、S分別用于擴增204位點野生型、YIDD突變、YVDD突變和YSDD突變的HBV DNA，反應C作為對照用于擴增所有HBV DNA。當ΔCt≤4(ΔCt=反應M、I、V或S-反應C的Ct值)時，表明被檢測樣本分別含有204位點野生型、YIDD突變型、YVDD突變型或YSDD突變型HBV DNA。當反應M、I、V或S中，有兩個或兩個以上的Ct值與反應C的Ct值之差≤4時，表明被檢測樣本含有204位點混合突變型HBV DNA。

1.3 DNA測序驗證 委托深圳華大基因股份有限公司對兩種方法獲得的PCR產物進行測序，并對測序結果進行比對。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

186例份血清樣本中，HBV DNA聚合酶204位點經PCR-RFLP技術、結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術檢測及基因測序驗證，均檢測出野生型HBV 62例(33.3%)；檢測出YIDD突變型分別有37(19.89%)、38(20.4%)、44例(23.7%)；檢測出YVDD突變型分別有30(16.1%)、31(16.7%)、32例(17.20%)；均未檢測到YSDD突變型；檢測出YMDD/YIDD混合型分別有13(6.99%)、13(6.99%)、12例(6.45%)；檢測出YMDD/YVDD混合型分別有17(9.14%)、16(8.60%)、17例(9.14%)；檢測出YIDD/YVDD混合型分別有27(14.52%)、26(13.98%)、19例(10.22%)。PCR-RFLP技術、結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術檢測結果與DNA測序驗證結果比較差異均無統計學意義(χ2=2.101、1.614，P均>0.05)。

186份血清樣本中，HBV DNA聚合酶180位點經PCR-RFLP技術、結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術檢測及基因測序驗證，均檢測出野生型HBV 139例(74.73%)；檢測出L180M突變型分別有9(4.84%)、9(4.84%)、9例(4.84%)；檢測出L180M+M204I混合型分別有21(11.30%)、20(10.75%)、22例(11.83%)；檢測出L180M+M204V混合突變型分別有17(9.14%)、18(9.68%)、16例(8.60%)。PCR-RFLP技術、結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術檢測結果與基因測序驗證結果比較差異均無統計學意義(χ2=0.054、0.213，P均>0.05)。

3 討論

核苷酸是合成人體遺傳物質DNA或RNA的原料。拉米夫定的化學本質是核苷類似物，其在結構上與核苷酸類似，但并不具有核苷酸的功能。因此，在DNA或RNA合成過程中，核苷類似物可以摻入進去，但卻不能合成有正常功能的核酸鏈，從而終止病毒復制。拉米夫定模擬的是胞嘧啶，其結構與天然人胞嘧啶結構不同，只能作用于病毒。目前認為，拉米夫定抑制HBV復制主要有三種途徑：①拉米夫定胞內磷酸化形成的活性三磷酸鹽與磷酸脫氧胞嘧啶核苷競爭HBV多聚酶的三磷酸核苷結合部位；②拉米夫定胞內磷酸化形成的活性三磷酸鹽導致HBV反轉錄酶、多聚酶的不可逆性、劑量依賴性抑制；③拉米夫定胞內磷酸化形成的活性三磷酸鹽競爭性摻入HBV DNA并導致鏈終止。但隨著拉米夫定用藥時間延長，可出現HBV耐藥。HBV拉米夫定耐藥基因突變與用藥時間長短有關，大多數乙肝患者用藥超過6個月，即可檢測出血清HBV DNA聚合酶204位點YIDD、YVDD、YSDD型基因突變或YMDD/YIDD、YMDD/YVDD、YIDD/YVDD混合突變，180位點L180M型基因突變或L180M+M204I、L180M+M204V混合突變[8,9]。甚至一些未接受任何抗乙肝病毒治療者也可能會出現類似基因突變[10～12]。不論出現哪種類型的基因突變，繼續服用拉米夫定則會出現耐藥，患者病情將進一步加重甚至惡化[13]。因此，應用拉米夫定治療一段時間，必須進行耐藥基因突變檢測，以指導后續治療。

PCR-RFLP技術和結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術均是基于PCR擴增原理，與目前常用檢測方法比較，其優點為易檢測出混合突變樣本；不需要購置大型設備，也不需要專門設計探針，對實驗室空間和技術人員要求相對較低，檢測費用較低。本研究結果顯示，兩種方法均能檢測出204位點和180位點突變及混合突變，且檢測結果與DNA測序驗證結果比較差異無統計學意義，說明這兩種方法均可用于大規模臨床檢測。但PCR-RFLP技術在PCR擴增后需要對擴增產物進行酶切，然后再電泳，操作相對復雜；而結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術擴增后可直接根據擴增曲線分析結果，不需要再進行其他實驗操作，相對更加方便。

HBV拉米夫定耐藥基因突變最常見的是YIDD、YVDD及其混合突變。本研究兩種方法雖檢測出相應的突變類型，但均未檢測出YSDD突變，其原因可能是YSDD突變需要較長時間，而本研究患者應用拉米夫定治療時間較短[14～16]。HBV拉米夫定耐藥突變初期，突變病毒株的DNA水平可能較低，DNA測序可能檢測不出[6]。本研究兩種技術均檢測出較低水平的混合突變病毒株。由此推測，在病毒基因突變早期采用這兩種方法檢測混合突變病毒株，對臨床及時更換治療方案具有重要意義，并可為社會節約大量的醫療資源。

綜上所述，PCR-RFLP技術和結合SYBR Green Ⅰ熒光染料的實時熒光PCR技術均可用于HBV拉米夫定耐藥基因突變檢測。但結合SYBR GreenⅠ熒光染料的實時熒光PCR技術實驗方法簡便，檢測過程快速、準確，檢測費用較低，更適合大規模耐藥基因突變篩查。

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