血清差異多肽檢測技術及其在女性生殖系統惡性腫瘤早期診斷中的應用現狀

張金玲，李巖

(1 暨南大學附屬第二臨床醫學院，廣東深圳518000；2 北京生物物理研究所)

近年來，隨著醫療技術的不斷發展，越來越多的研究者致力于尋找理想的腫瘤標志物，以期實現腫瘤的早期診斷。目前尚未發現診斷女性生殖系統惡性腫瘤敏感性和特異性均較高的專屬腫瘤標志物。多肽組學是蛋白質組學的一個分支，近年來受到越來越多的關注，逐漸成為各領域研究的熱點。組織內的一些蛋白質降解后的多肽片段，可通過某種途徑進入血液循環，在機體生理和病理生理過程中發揮重要作用[1]，如內分泌調節、營養物質傳遞、免疫調節、抗腫瘤、抗氧化等。血清差異多肽譜是通過檢測血液中差異多肽片段所獲得的圖譜，可用于尋找某些疾病在血液中的潛在分子標志物，并用于疾病的篩查和診斷[2]。本文就血清差異多肽譜在宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌早期診斷中的應用進展作一綜述。

1 血清差異多肽及其檢測技術

1.1 血清差異多肽的作用 多肽通常是指分子量不超過10 kD的小分子量蛋白，由兩個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物為二肽，由三個或三個以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物稱為多肽。多肽在人體內具有不可替代的調節作用，幾乎涉及到人體的所有生理活動，被喻為人體內的“信息使者”“體內戰場的指揮官”。人體體液均可作為獲取多肽的來源，以血清中多肽最容易獲得。血清中小分子多肽片段可參與部分疾病的病理生理過程，為發現疾病的發生、發展規律提供重要的科學依據。在健康人群和腫瘤患者的血清中尋找差異多肽，從而建立血清差異多肽譜，可為腫瘤的早期診斷、病情程度評估等提供依據[3]。目前已發現的與腫瘤相關的差異多肽，有的是具有生理功能的多肽分子，如鐵調素、補體C3f片段等[4]，有的是高豐度蛋白降解片段[5，6]。這些差異多肽可反映其母蛋白含量變化，也能體現與其產生相關的蛋白酶含量變化。

1.2 血清差異多肽檢測技術 血清中高豐度、高分子量的蛋白質，如清蛋白、α1抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白等占總蛋白質的99%以上，這些蛋白會嚴重干擾血清多肽檢測[7]，常規檢測手段無法排除這些蛋白質的干擾。根據多肽與高分子量蛋白質的極性、電荷、溶解度及分子尺寸等特性不同，研究者建立了多種多肽分離方法，如反相色譜法、離子交換色譜法、有機溶劑沉淀法、超濾法等以及納米芯片技術等[8]。目前檢測血清多肽效果最好的技術是納米芯片富集多肽結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術。納米多肽芯片是集現代生物技術、信息技術、微電子技術和微機電技術為一體的高新技術芯片，主要是通過微加工和微電子技術在固體芯片表面構建微型生物化學分析系統，以實現對機體的生物組分進行準確快速的富集前處理過程，其在硅片上合成一層約700 nm厚、孔徑3 nm左右的多孔硅結構膜，可對血清中的多肽組分進行有效富集[9]。MALDI能通過檢測待測樣品中不同成分的分子量及離子強度來展示待測樣品的特征，具有敏感性高、特異性強、質量檢測范圍廣、使用簡單快捷等優點。這兩種新型生物技術有機結合，即MALDI-TOF-MS技術，可檢測大量多肽和小分子蛋白質的混合樣本，在識別生物反應機制和細胞途徑狀況的復雜蛋白質組圖譜方面效果顯著。目前，該技術已成功用于多種荷瘤小鼠以及人體樣本的生物和臨床檢測中[10～14]。

2 血清差異多肽譜在生殖系統惡性腫瘤早期診斷中的應用

2.1 血清差異多肽譜在宮頸癌中的應用 人乳頭瘤病毒(HPV)感染，尤其是高危HPV持續感染是宮頸癌的致病因素。目前，已將HPV檢測廣泛用于宮頸癌篩查，其敏感性雖高，但特異性差，僅能作為初篩手段，對于宮頸癌的診斷、預后評估等仍需根據臨床病理結果。隨著腫瘤分子生物學的研究進展，運用血清差異多肽檢測技術建立宮頸癌的血清差異多肽譜，為宮頸癌的早期診斷和預后評估等提供了更多選擇空間。Liu等[15]通過PBSⅡ-C蛋白芯片技術、運用Biomarker Wizard系統分析血清差異多肽譜，篩選確定了3個相對分子質量分別為3 974、4 175、5 906的差異多肽，這3個差異多肽預測宮頸癌的敏感性為93.3%、特異性為95.0%，表明血清差異多肽可用于宮頸癌的篩查。Song等[16]采用MALDI-TOF-MS技術發現了20個在宮頸癌血清中差異表達的多肽，經過免疫組化、PCR等篩選，確定B-FABP、NCK-1、CDK4可作為宮頸癌的腫瘤標志物，可用于宮頸癌的早期診斷及預后評估指標。

2.2 血清差異多肽譜在子宮內膜癌早期診斷中的應用 目前子宮內膜癌的篩查主要依靠診斷性刮宮，子宮內膜取材常用抽吸法，但抽吸法取材容易漏診[17]。目前新的篩查策略業內尚未達成統一認識，臨床上也缺少特異性高的早期診斷標志物[18]。尋找敏感、特異的子宮內膜癌分子標志物是早期預測子宮內膜癌的關鍵。已有學者研究證實，血清差異多肽可用于子宮內膜癌腫瘤標志物的篩選，為尋找子宮內膜癌的分子標志物提供了理論依據。Yoshizaki等[19]應用SELDITOF-MS技術發現子宮內膜癌患者血清中差異表達多肽EC1、EC2，并認為二者可能成為子宮內膜癌的腫瘤標志物。Li等[20]應用MALDI-Q-TOF技術篩選出了112個子宮內膜癌患者血清差異多肽，經鑒定確定親環素A、表皮脂肪酸結合蛋白、Alcyphosine等為子宮內膜癌相關蛋白候選分子；并驗證了該蛋白在子宮內膜癌組織中表達明顯變化，且其表達變化與子宮內膜癌組織病理學分級有關。Zhu等[21]利用SELDI-TOF-MS技術篩選了子宮內膜癌患者13個相對分子量為2 000～50 000的血清差異多肽，并建立子宮內膜癌多肽譜模型，發現其診斷子宮內膜癌的敏感性為92.5%、特異性為100%、診斷符合率為95.7%。

2.3 血清差異多肽譜在卵巢癌早期診斷中的應用 目前尚無標準的卵巢癌篩查方法。血清腫瘤標志物在卵巢癌診斷中具有重要價值，但多數標志物敏感性不高、特異性不強[22]。仇志琴等[23]應用MALDI-TOF-MS技術篩選上皮性卵巢癌的血清差異多肽，建立的血清差異多肽診斷模型預測早期卵巢癌的準確性達到81.8%。Qiu等[24]利用MB-WCX預處理卵巢癌患者血清樣本，采用ClinProTools軟件分析獲得了5個作為兩組分類的差異多肽和蛋白，建立了卵巢癌血清診斷模型，其敏感性及特異性均在90%以上，提示MALDI-TOF-MS技術可作為卵巢癌早期診斷的潛在分子生物學標志物。Li等[25]通過MALDI-TOF-MS技術對上皮性卵巢癌耐藥細胞株的22個蛋白質點進行分析，其中16個蛋白質表達了強度不同的特異性，并且確定了絲切蛋白1在紫杉醇抗性中發揮重要作用，這為卵巢癌耐藥機制的研究奠定了基礎，也為臨床選藥、評估療效以及藥物靶向治療提供實驗基礎。Zhang等[26]通過MALDI-TOF技術發現，卵巢癌患者血清載脂蛋白A1、甲狀腺素轉運蛋白水平低于正常健康者；之后，基于蛋白組學圖譜發現了聯合標志物OVA1，包括CA125、載脂蛋白A1、甲狀腺素轉運蛋白、β2微球蛋白和轉鐵蛋白，可作為預測卵巢腫瘤的輔助手段[27]。因此，血清差異多肽譜能夠作為卵巢癌的分子標志物，是早期篩查子宮內膜癌的一種新方法。

綜上所述，利用血清多肽差異譜技術能成功地篩選出宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌等女性生殖系統惡性腫瘤的差異多肽，并通過血清差異多肽建立多種針對女性生殖系統惡性腫瘤的血清差異多肽譜診斷模型，其敏感性高、特異性好，對女性生殖系統惡性腫瘤的早期診斷、預后評估等具有重要的指導意義。但臨床還需要在大規模樣本中進一步驗證。另外，由于樣本選取標準、預處理方法不同、分析軟件以及人為因素等原因，導致實驗結果的差異蛋白有所不同，未來需要更大規模的規范審查以制訂規范化的診斷標準。

參考文獻：

[1] Han X, Aslanian A, Yates JR 3rd. Mass spectrometry for proteomics[J]. Curr Opin Chem Biol, 2008,12(5):483-490.

[2] Boja ES, Rodriguez H. The path to clinical proteomics research: integration of proteomics, genomics, clinical laboratory and regulatory science[J]. Korean J Lab Med, 2011,31(2):61-71.

[3] Schrader M, Schulz-Knappe P, Fricker LD. Historical perspective of peptidomics[J]. EuPA Open Proteom, 2014(3):171-182.

[4] Noble S. Low-molecular-weight heparin and survival in lung cancer[J]. Thromb Res, 2012,129(Suppl 1):S114-S118.

[5] Profumo A, Mangerini R, Rubagotti A, et al. Complement C3f serum levels may predict breast cancer risk in women with gross cystic disease of the breast[J]. J Proteomics, 2013(85):44-52.

[6] Villanueva J, Shaffer DR, Philip J, et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns[J]. J Clin Invest, 2006,116(1):271-284.

[7] Pernemalm M, Lewensohn R, Lehtio J. Affinity prefractionation for MS-based plasma proteomics[J]. Proteomics, 2009,9(6):1420-1427.

[8] 魏黎明，陸豪杰，楊芃原，等.肽組學樣品前處理方法與技術進展[J].色譜，2013，31(7)：603-612.

[9] Hu Y, Bouamrani A, Tasciotti E, et al. Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein[J]. ACS Nano, 2010,4(1):439-451.

[10] Fan J, Huang Y, Finoulst I, et al. Serum peptidomic biomarkers for pulmonary metastatic melanoma identified by means of a nanopore-based assay[J]. Cancer Lett, 2013,334(2):202-210.

[11] Fan J, Tea MK, Yang C, et al. Profiling of cross-functional peptidases regulated circulating peptides in BRCA1 mutant breast cancer[J]. J Proteome Res, 2016,15(5):1534-1545.

[12] Deng Z, Li Y, Fan J, et al. Circulating peptidome to indicate the tumor-resident proteolysis[J]. Sci Rep, 2015(5):9327.

[13] Li Y, Li Y, Chen T, et al. Circulating proteolytic products of carboxypeptidase N for early detection of breast cancer[J]. Clin Chem, 2014,60(1):233-242.

[14] Fan J, Deng X, Gallagher JW, et al. Monitoring the progression of metastatic breast cancer on nanoporous silica chips[J]. Philos Trans A Math Phys Eng Sci, 2012,370(1967):2433-2447.

[15] Liu C, Pan C, Shen J, et al. Discrimination analysis of mass spectrometry proteomics for cervical cancer detection[J]. Med Oncol, 2011,28(Suppl 1):S553-S559.

[16] Song JY, Bae HS, Koo DH, et al. Candidates for tumor markers of cervical cancer discovered by proteomic analysis[J]. J Korean Med Sci, 2012,27(12):1479-1485.

[17] 任玉蘭，王華英，施達仁，等.晚期子宮內膜癌患者的治療與預后分析[J].中華婦產科雜志，2008，43(7)：523-527.

[18] 馬榮，耿曉星，唐麗萍，等.人附睪分泌蛋白4檢測對子宮內膜癌的診斷及預后的意義[J].臨床腫瘤學雜志，2011，16(9)：790-793.

[19] Yoshizaki T, Enomoto T, Nakashima R, et al. Altered protein expression in endometrial carcinogenesis[J]. Cancer Lett, 2005,226(2):101-106.

[20] Li Z, Min W, Huang C, et al. Proteomics-based approach identified differentially expressed proteins with potential roles in endometrial carcinoma[J]. Int J Gynecol Cancer, 2010,20(1):9-15.

[21] Zhu L, Zhang WY, Yu L, et al. Proteiomic patterns for endometrial cancer using SELDI-TOF-MS[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2008,9(4):286-290.

[22] Kristin LM, Kate G, Koopeiners JS, et al. A Multiplex platform for the indenfication of serum biomarkers for the early detection of ovarian cancer[J]. Clin Cancer Res, 2017,23(11 Suppl):DPOC011.

[23] 仇志琴，黃玉政，陶永輝，等.血清差異表達多肽譜用于人卵巢癌診斷的研究[J].南方醫科大學學報(自然科學版)，2012，32(7)：1029-1032.

[24] Qiu F, Liu HY, Dong ZN, et al. Searching for potential ovarian cancer biomarkers with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. Am J Biomed Sci, 2009,1(1):80-90.

[25] Li M, Yin J, Mao N, et al. Upregulation of phosphorylated cofilin 1 correlates with taxol resistance in human ovarian cancer in vitro and in vivo[J]. Oncol Rep, 2013,29(1):58-66.

[26] Zhang Z, Bast RC Jr, Yu Y, et al. Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2004,64(16):5882-5890.

[27] Fung ET. A recipe for proteomics diagnostic test development: the OVA1 test, from biomarker discovery to FDA clearance[J]. Clin Chem, 2010,56(2):327-329.