下調lncRNA CRNDE表達對結直腸癌HCT116細胞增殖和遷移的影響

高志鵬，徐萬鵬，喬斌，楊斌林，段全紅

(1 濰坊醫學院，山東濰坊261053；2 濰坊醫學院附屬醫院)

研究發現，多種長鏈非編碼RNA(lncRNA)在惡性腫瘤的發生、發展過程中扮演重要角色[1～4]。結直腸惡性腫瘤差異表達基因(CRNDE)是一種較早發現于結直腸癌細胞中的高表達lncRNA。已有研究報道，在膠質瘤、髓母細胞瘤、腎癌等多種腫瘤組織中lncRNA CRNDE表達上調[5～7]。Liu等[8]研究發現，結直腸癌組織lncRNA CRNDE表達變化與患者預后有關。但lncRNA CRNDE在結直腸癌細胞增殖及遷移中的作用鮮見報道。2016年11月～2017年6月，本研究通過siRNA技術靶向干擾結直腸癌HCT116細胞(以下稱HCT116細胞)中lncRNA CRNDE表達，觀察lncRNA CRNDE表達變化對結直腸癌細胞增殖和遷移的影響。現分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HCT116細胞，購自中國科學院細胞庫。lncRNA CRNDE特異性siRNA，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；lncRNA CRNDE及GAPDH PCR引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成。Mastercycler Ep Realplex實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計、Multiskan MK3型酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光倒置顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社。McCOY′s5A細胞培養液，美國Solarbio公司；Opti-MEM?Ⅰ Reduced Serum Medium，美國Gibco公司；Lipofectamine?2000，美國Invitrogen公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 細胞培養傳代 將HCT116細胞接種于含10% FBS McCOY′s5A培養液的培養瓶，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。當細胞融合達90%時，加入0.25% Trypsin-EDTA消化，按1∶3比例傳代。取傳10代內對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 lncRNA CRNDE-siRNA轉染及轉染效率驗證 將對數生長期HCT116細胞接種于6孔板，每孔2×105個，隨機分為CRNDE siRNA組、陰性對照組、空白對照組，每組設3個復孔。各組常規培養24 h，CRNDE siRNA組加入lncRNA CRNDE-siRNA(正義鏈：5′-GCUCGAGUGGUUUAAAUAUTT-3′，反義鏈：5′-AUAUUUAAACCACUCGAGCTT-3′)轉染，陰性對照組加入無關序列NC-siRNA(正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACG-UGACACGUUCGGAGAATT-3′)轉染，空白對照組不予轉染。所有操作嚴格按Lipofectamine?2000說明書進行。各組均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。轉染48 h，收集細胞，采用RNAiso Plus提取細胞總RNA，經NanoDrop 2000c超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的總RNA純度和完整性符合實驗要求。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。根據CRNDE信息，使用Primer5.0軟件設計引物。引物序列：lncRNA CRNDE上游引物5′-CGCG-CCCGCGCGGCGGAGGA-3′，下游引物5′-AGTATGAATTGCAGACTTTGCA-3′；內參GAPDH上游引物5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游引物5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。根據SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA CRNDE mRNA相對表達量。結果顯示，空白對照組、陰性對照組、CRNDE siRNA組lncRNA CRNDE mRNA相對表達量分別為1.000±0.000、0.923±0.015、0.135±0.023。CRNDE siRNA組lncRNA CRNDE mRNA相對表達量明顯低于空白對照組、陰性對照組(P均<0.05)，而空白對照組與陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。說明lncRNA CRNDE-siRNA成功下調了HCT116細胞lncRNA CRNDE表達。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。取對數生長期HCT116細胞，按1.3中方法進行分組和轉染。各組分別于轉染24、48、72 h每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度下孵育3 h，Multiskan MK3型酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度(A)值。以A450值表示細胞增殖能力。

1.5 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。實驗前預先用記號筆在6孔板每孔背面橫穿孔心均勻、筆直地畫橫線。取對數生長期HCT116細胞，按1.3中方法進行分組和轉染。轉染24 h，使用微量移液器槍頭垂直于預先畫好的橫線再次劃痕，PBS小心漂洗3次，去除劃下的細胞。隨機挑選3個視野，記錄位置并拍照。將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養48 h，顯微鏡下拍照，采用Image-Pro Plus6.0軟件測量各組細胞遷移距離。

2 結果

2.1 各組轉染不同時間細胞增殖能力比較 見表1。

表1 各組轉染不同時間細胞增殖能力比較

注：與空白對照組同時間比較，*P<0.05；與陰性對照組同時間比較，#P<0.05；與同組轉染24 h比較，△P<0.05；與同組轉染48 h比較，▲P<0.05。

2.2 各組細胞遷移能力比較 CRNDE siRNA組、陰性對照組、空白對照組轉染24 h細胞遷移距離分別為(5.265±0.443)、(16.188±0.799)、(18.233±2.087)pixel。CRNDE siRNA組細胞遷移距離明顯小于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

lncRNA廣泛存在于細胞核和細胞質中，是長度大于200個核苷酸、不能編碼蛋白質但具有基因表達調節功能的一類RNA[9]。lncRNA在轉錄調控、轉錄后調控及表觀遺傳學調控方面具有重要作用，如染色體修飾、X染色體沉默、DNA甲基化、干擾核內運輸、轉錄激活或沉默等[10]。在惡性腫瘤的發生、發展中，常伴隨lncRNA異常表達。Svoboda等[11]報道，在結直腸癌組織中lncRNA HOTAIR可出現差異表達，并與腫瘤分期、淋巴結轉移及患者預后密切相關。Alaiyan等[12]研究發現，lncRNA CCAT1在結直腸腺瘤進展至惡性腫瘤過程中表達逐步上調，并且其表達變化還與腫瘤轉移有關。有研究還發現，lncRNA UCA1在結直腸癌細胞增殖、凋亡等一系列生物學過程中發揮重要作用[13]。由此推測，lncRNA異常表達可能與惡性腫瘤的發生、發展有關。

在眾多與結直腸癌相關的lncRNA中，CRNDE是一種在結直腸癌細胞中最早發現的差異性高表達lncRNA。Graham等[14]研究發現，結直腸癌患者血清中lncRNA CRNDE高表達。Liu等[8]研究證實，在結直腸癌組織中lncRNA CRNDE高表達，并與腫瘤轉移和患者不良預后密切相關。有研究還發現，lncRNA CRNDE在宮頸癌、急性粒細胞白血病、前列腺癌等組織或細胞中的表達亦明顯升高，并與疾病進展有關[15～17]。由此推斷，lncRNA CRNDE在腫瘤的發生、發展過程中具有癌基因作用。Khalil等[18]研究發現，lncRNA CRNDE和染色質修飾復合體多梳蛋白聚合體2(PRC2)基因與組蛋白的重組過程有關，并且lncRNA CRNDE可通過甲基化或去甲基化的方式影響PRC2和RE-1元件輔助沉默因子相關基因表達。因此推測，lncRNA CRNDE可通過表觀遺傳修飾來調控腫瘤的發生、進展。lncRNA CRNDE轉錄本表達受胰島素/IGF起始的PI3K/Akt/mTOR和Raf/MAPK兩條信號通路調控。Ellis等[19]通過抑制結直腸癌細胞HCT116和HT29中lncRNA CRNDE gVC-In4轉錄本的表達發現，其可影響一系列與insulin/IGF通路相關的基因表達。據此推測，lncRNA CRNDE可能參與腫瘤細胞有氧糖酵解的調控，繼而參與結直腸癌的發生、發展。但目前關于抑制lncRNA CRNDE表達對結直腸癌細胞增殖和遷移的影響鮮有報道。

本研究利用siRNA技術靶向抑制結直腸癌HCT116細胞lncRNA CRNDE表達，觀察下調lncRNA CRNDE表達對HCT116細胞增殖和遷移的影響。結果發現，隨著轉染時間延長，各組細胞增殖能力逐漸升高，但CRNDE siRNA組轉染24、48、72 h細胞增殖能力均低于同期陰性對照組和空白對照組；CRNDE siRNA組轉染24 h再培養48 h細胞遷移距離均小于陰性對照組和空白對照組。上述結果證實，下調lncRNA CRNDE表達可抑制HCT116細胞增殖和遷移。據此推測lncRNA CRNDE可能促進結直腸癌的侵襲和轉移。

綜上所述，下調lncRNA CRNDE表達能抑制結直腸癌細胞增殖和遷移。本研究為探討結直腸癌侵襲和轉移的分子機制及其治療潛在靶點提供了新思路。

參考文獻：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Xiao YC, Yang ZB, Cheng XS, et al. CXCL8, overexpressed in colorectal cancer, enhances the resistance of colorectal cancer cells to anoikis[J]. Cancer Lett, 2015,361(1):22-32.

[3] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[4] Gutschner T, Diederichs S. The hallmarks of cancer: a long non-coding RNA point of view[J]. RNA Biol, 2012,9(6):703-719.

[5] Guttman M, Amit I, Garber M, et al. Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals[J]. Nature, 2009,458(7235):223-237.

[6] Harrington S, McGurk M, Llewellyn CD. Positive consequences of head and neck cancer: key correlates of finding benefit[J]. J Psychosoc Oncol, 2008,26(3):43-62.

[7] Kate N, Grover S, Kulhara P, et al. Relationship of caregiver burden with coping strategies, social support, psychological morbidity, and quality of life in the caregivers of schizophrenia[J]. Asian J Psychiatr, 2013,6(5):380-388.

[8] Liu T, Zhang X, Yang YM, et al. Increased expression of the long noncoding RNA CRNDE-h indicates a poor prognosis in colorectal cancer, and is positively correlated with IRX5 mRNA expression[J]. Onco Targets Ther, 2016(9):1437-1448.

[9] Chen LL, Carmichael GG. Long noncoding RNAs in mammalian cells: what, where, and why[J]. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2010,1(1):2-21.

[10] Li CH, Chen Y. Targeting long non-coding RNAs in cancers: progress and prospects[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013,45(8):1895-1910.

[11] Svoboda M, Slyskova J, Schneiderova M, et al. HOTAIR long non-coding RNA is a negative prognostic factor not only in primary tumors, but also in the blood of colorectal cancer patients[J]. Carcinogenesis, 2014,35(7):1510-1515.

[12] Alaiyan B, Ilyayev N, Stojadinovic A, et al. Differential expression of colon cancer associated transcript1 (CCAT1) along the colonic adenoma-carcinoma sequence[J]. BMC Cancer, 2013(13):196.

[13] Han Y, Yang YN, Yuan HH, et al. UCA1, a long non-coding RNA up-regulated in colorectal cancer influences cell proliferation, apoptosis and cell cycle distribution[J]. Pathology, 2014,46(5):396-401.

[14] Graham LD, Pedersen SK, Brown GS, et al. Colorectal Neoplasia Differentially Expressed (CRNDE), a novel gene with elevated expression in colorectal adenomas and adenocarcinomas[J]. Genes Cancer, 2011,2(8):829-840.

[15] Chaves C, Vazquez C, Hervas G. Benefit finding and well-being in children with life threatening illnesses: an integrative study[J]. Terapia Psicologica, 2013,31(1):59-68.

[16] Le Dieu R, Taussig DC, Ramsay AG, et al. Peripheral blood T cells in acute myeloid leukemia (AML) patients at diagnosis have abnormal phenotype and genotype and form defective immune synapses with AML blasts[J]. Blood, 2009,114(18):3909-3916.

[17] Pressinotti NC, Klocker H, Sch?fer G, et al. Differential expression of apoptotic genes PDIA3 and MAP3K5 distinguishes between low- and high-risk prostate cancer[J]. Mol Cancer, 2009(8):130.

[18] Khalil AM, Guttman M, Huarte M, et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression[J]. Proc Nati Acad Sci U S A, 2009,106(28):11667-11672.

[19] Ellis BC, Graham LD, Molloy PL. CRNDE, a long non-coding RNA responsive to insulin/IGF signaling, regulates genes involved in central metabolism[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1843(2):372-386.