組織工程皮膚及其生物反應器的研究進展

王洋，伍津津

(1中國人民解放軍第211醫院，哈爾濱 150001；2中國人民解放軍陸軍軍醫大學大坪醫院)

20世紀80年代提出了組織工程這一新概念，其已發展成為一門新興的學科。當前組織工程的研究核心是將生物材料與有生物學活性的組織細胞相結合，實現體外構建組織與器官，從而達到維持、修復、改善或再生損失組織與器官的功效。因此，組織工程是一門生物科學與工程科學緊密結合的前沿學科。如何在體外構建組織和器官從而來模擬體內生理條件的三維環境是極其重要的。van Wezel[1]于20世紀60年代最先借助微載體法成功懸浮培養出了動物貼壁細胞。可見在生物反應器中，基于微載體法進行體外大規模擴增動植物細胞是最常用，且最有效的途徑。近年來，組織工程生物反應器研制取得了重大突破，其形式多樣，如攪拌式、中空纖維式、氣升式、單軸和雙軸旋轉壁式等[2]。目前，組織培養生物反應器已在骨和軟骨組織工程、人體干細胞大規模體外擴增、組織工程皮膚和其他人體器官修復領域得到廣泛重視。現就組織工程皮膚及其生物反應器的研究進展情況做一綜述。

1 組織工程皮膚

皮膚由表皮、真皮和皮下組織組成，是人體最大、最復雜的器官，其功能不只是人體的屏障，還包括免疫、內分泌、生理代謝、神經傳導等生理功能[3]，而皮膚缺損是一種常見的組織損傷性疾病[4]。與正常皮膚組織一樣，組織工程皮膚包含角質層、表皮層和真皮層等，其出現為大面積皮膚缺損患者的治療提供了一種新的有效方法[5]。目前，組織工程皮膚主要有人工表皮替代物、人工真皮替代物、人工復合皮替代物。

1.1 人工表皮替代物 表皮細胞的成功培養為組織工程皮膚的研究奠定了基礎[6]。在組織工程皮膚的構建及燒傷、慢性創面治療過程中，表皮細胞尤為重要，是實現創面上皮化的關鍵細胞。患者自身的表皮細胞是創面治療的首選，然而在短時間內大規模獲取及大量擴增表皮細胞受到一定的阻礙，這使得組織工程皮膚及表皮細胞膜片等的應用存在困難。從培養模式及培養基的選擇考慮，表皮細胞的培養主要分為有、無滋養層培養及有、無血清培養和體內、外培養。Ronfard等[7]以纖維蛋白基質為載體，培養了自體表皮細胞，并將其用于Ⅲ度燒傷患者創面的修復，實現了上皮層的重建。人工表皮替代物的臨床應用雖取得了一定的成功，但總體由于缺少真皮結構，單純表皮膜片用于創面修復時，尤其是用于較深的全層皮膚缺損修復時，暴露出了不少問題與缺陷，如易破碎、抗感染力差、移植后易形成水泡等，因此難以達到理想的功效。

1.2 人工真皮替代物 在皮膚重建過程中，真皮替代物扮演重要角色，如增加創面愈合后的皮膚彈性、柔軟性及機械耐磨性等，減少瘢痕增生；此外，有些真皮替代物中存在的活性纖維母細胞(Fbs)可促進表皮生長分化，從而誘導基底膜的形成。因此，人工真皮的研制一直是組織工程皮膚領域的研究熱點之一。目前，人工真皮替代物主要有異體脫細胞真皮替代物、合成基質真皮替代物和異體Fbs真皮替代物。在某些方面，真皮替代物很好地彌補了表皮替代物的缺陷，具有較好的應用前景，但它仍有一些問題，如水分易丟失，需二次表皮移植等。

1.3 人工復合皮膚 人體的正常皮膚是由表皮和真皮所構成，也就是說無法用單一的表皮替代物或真皮替代物來代替，從而實現皮膚結構和功能的完整性。因此，所開發出的理想人工皮膚替代物應同時具備表皮和真皮兩種結構，即應當是一種復合型的皮膚替代物。當前，已開發出的最為成熟的Apligraf人工復合皮膚，是含有Fbs和異體上皮細胞的雙層組織工程皮膚[8]。

2 組織工程皮膚生物反應器

2.1 當前組織工程皮膚培養面臨的問題及解決方案 組織工程皮膚中的核心工作主要有體外培養與擴增種子細胞、制備胞外支架材料、構建與移植人工皮膚組織。然而制約人工皮膚組織研究、發展及其產業化的關鍵因素主要有種子細胞數量不足、細胞功能老化(長期傳代所誘發的)等問題。所以，現階段亟需解決的技術“瓶頸”就是如何制備大量且高質量的皮膚種子細胞[9]。通常，先將皮膚種子細胞接種至支架材料上，構建了工程化的組織，然后經過一定時間的體外培養，實現細胞的增生、分化以及外基質的分泌，使其成熟后才可以移植。目前，最常用的方法是定期換液靜態培養法(即為批式培養)，即通過移去舊培養液的方式進行，優勢是具有個體化的特點；但缺點顯而易見，一是培養液的消耗呈進行性下降，而代謝產物不斷增加，一方面會對細胞造成一些生理性損傷，影響三維構建物的功能形成，另一方面會造成pH上升，對細胞的生長、增殖和分化等有一定的影響；二是通過換液后又使培養液的營養成分呈現出周期性的波動，不利于細胞的均勻生長和增殖；三是這種批式靜態培養主要依靠人工操作，勞動強度大，工耗高，效率低，只適用于實驗室級的培養，不適合大批量生產；四是依靠彌散方式提供營養，存在營養供應受限的顯著缺點，尤其是構建內部的細胞得不到營養，造成死亡[10]。目前解決這一問題的有效方法是通過生物反應器來改善其傳質過程。眾所周知，天然皮膚有低應力環境和與空氣直接接觸的特點。因此，工程化皮膚組織的首要條件是需要氣液界面培養，其次才是提供一個相對低的應力環境。可見，一個具有灌流腔室的生物反應器可實現上述功能：培養基的連續供給和氣液界面的維持[11,12]。灌流室模型的生物反應器是灌流室及其上方的半透膜所構成的。半透膜的上部空間主要用于表皮細胞的培養或組織工程皮膚的構建[13，14]。

2.2 灌注式生物反應器類型 用于組織工程皮膚培養的灌注式生物反應器，其結構由培養室和進出管路(用于循環培養基)組成。由于培養室的可操作空間非常小的緣故，通常將氧合作用在生物反應器的外部進行，也就是說氧合后的培養基通過管路系統進入培養室。目前，最簡單的灌注式生物反應器由一個培養室(通常為長方體形)、一個入口管路和一個出口管路所組成；其次，從概念設計層面來說，可設計多個培養基的進出口，其在培養室壁面上的分布多樣化，且可優化培養室的形狀。根據研究對象的不同，學者們設計了多種適用于組織工程皮膚的灌注式生物反應器。用于種子細胞擴增的生物反應器，包括小規模、大規模擴增種子細胞的裝置。常用的有轉瓶、多層托盤或多層繁殖器、微載體法的攪拌生物反應器。

2.2.1 Kerator反應器 在組織工程皮膚中，研究[10～12]首先成功研制了用于角質形成細胞擴增的生物反應器。這是一種五層式的角質形成的細胞培養裝置，由單個獨立的培養室重疊在一起，每層的培養面積達到630 cm2，層與層之間通過管路連接，擴增培養的角質形成細胞從增生、構建雙層皮膚等方面與方瓶培養沒有差異。其優點是實現了角質形成的規模化擴增，消化傳代、換液、培養實現程序化，裝配有顯微鏡圖像采集系統供細胞生長觀察。其缺點也很明顯，一是管路過多，給裝置的清洗和消毒造成一定的困難，二是體積過大，三是擴展性差，四是裝配較復雜，不便操作。

2.2.2 雙重功能的生物反應器 Sun等[15]設計了一個具有雙重功能的封閉系統。此系統不僅可用于種子細胞的接種，還可用于氣液界面的培養，由培養室、支持架、支架基質、細胞接種網格和接種環、管路等組成，支架基質由支持架支撐，浮在培養液上，表面有4個或9個接種室來接種細胞，液體通過側面的管路實現循環(流速為0.5 mL/h)；該培養系統可做連續灌注或批式培養，支架基質可為脫細胞的真皮基質、電紡絲的聚苯乙烯或聚苯乙烯與聚乳酸的電紡絲復合物。

2.2.3 MINUTH灌注式培養容器 Kremer等[16]采用的是MINUTH灌注式培養容器，其結構原理和Sun等[15]的有一些類似之處，但為浸沒培養而不是氣液界面培養，沒有細胞接種網格和接種環，灌注速度為1 mL/h；將角質形成細胞接種到人工真皮模板上灌注培養5 d以上，并移植到裸鼠，結果表明從組織學上看與靜態培養區別不大，但有明顯改善細胞生長，對傷口的黏附性好并達到完全愈合。

2.2.4 Kalyanaraman型生物反應器 Kalyanaraman等[10]設計則完全不同，為了保證工程化組織的氣液界面培養，管路是從培養室底面開口，通過管子的高度來控制液面高度，液面溢出管子高度后才流出來；采用此培養系統對構建的組織皮膚替代物進行熟化培養。研究表明，在灌注速度為5、15 mL/min培養條件下，組織學結構好于靜態培養；檢測結果表明5 mL/min的灌注速度明顯好于靜態培養；同時通過細胞增殖檢測法(BrdU摻入法)檢測細胞的增生情況也表明在5、15 mL/min時明顯好于對照，而50 mL/min時只顯示少量增生，結果證明低流速能夠增加細胞活力和維持表皮的屏障，適合于移植，而高流速則導致細胞的變性壞死。

2.3 灌注式培養的優點 溫旭紅[11]運用兩步酶消化法分離培養人的角質形成細胞、成纖維細胞，制備含有毛乳頭細胞凝膠球的組織工程雙層細胞，并通過灌注式生物反應器進行動態培養。在與靜態培養結果分析對比發現，在灌注培養中毛乳頭細胞凝膠球與組織工程皮膚(由人的角質形成細胞、成纖維細胞所構建的)更好地契合，并能形成類似“毛芽”的結構，這充分說明了灌注式生物反應器較靜態培養更適合于組織工程皮膚的培養。周燕等[18]實驗研究皮膚成纖維細胞在方瓶、轉瓶和生物反應器中的生長和擴增，發現采用相同微載體濃度的前提下，在所獲得的最大細胞密度方面，基于生物反應器培養方式是基于轉瓶培養方式的1.43倍，同時是基于方瓶靜止培養方式的9.16倍；此外，在細胞的比生長速率方面，基于生物反應器培養方式是基于轉瓶培養方式的1.88倍，是基于方瓶培養方式的3.98倍。同時基于生物反應器培養方式的倍增時間最短，從而顯著地減少了培養周期，且傳代培養一次，細胞擴增高達29.7倍，但在轉瓶和方瓶培養方式中進行傳代培養一次，細胞擴增卻只有18.6倍和4.54倍。然而最為重要的一點是，采用生物反應器培養系統可以顯著增大種子細胞的擴增效率。借助微載體與生物反應器來懸浮培養皮膚成纖維細胞，可有效并迅速地制備大量的種子細胞，從而為大面積皮膚組織的構建提供了重要保障。上述研究表明灌注式培養有顯著的優點：①克服了營養物質傳遞受到限制的缺陷，這是因此培養基可以連續地流經三維構建物內部或周圍，從而更接近體內的生理特點；②當構建物厚度超過500 μm時，營養供應也可以得到保障；③液流可產生一定大小的剪切力，從而提供一定的機械刺激，對構建物的發育與成熟是極其有利的；④三維構建物一直處于新鮮的培養液中，這極其有效地避免了細胞因子的旁分泌作用過度和代謝產物的非生理性累積[19]。因此，灌注式培養已成為組織工程最有前途的培養方式。

2.4 未來發展趨勢 由于皮膚組織的特殊性，體外培養時與其他組織器官顯著不同的是要求氣液界面培養條件，這意味著表皮層的營養和氧供應須通過真皮層的滲透而來，表皮層表面接觸空氣才利于角質形成細胞的分化和角質層形成。這幾種用于組織工程皮膚培養的方案都是采用灌注培養，雖然部分裝置實現了氣液界面培養，但都存在比表面積小、擴展性差、結構復雜和流場不均勻等缺點。由于流場不均一，存在營養傳遞不均的現象，邊緣液體不易流動，容易造成細胞壞死；由于流場對細胞的剪切力不同，勢必對細胞的功能產生不同的影響，Kalyanaraman等的結果也充分說明了這一點，在高流速(50 mL/min)情況下細胞的活力反而不如低流速(5 mL/min)并出現變性壞死。此外，這些培養裝置的灌注速度是通過實驗摸索出來的，缺乏數值模擬分析，其操作條件和培養室結構還需要進一步優化。而解決這些問題的根本手段就是需要引入工程學的原理和手段，Matin等認為應通過模擬的方法來預測生物反應器系統所提供的最佳液流環境，而不是通過反復的實驗來確定[20]。Wendt等[21]認為，生物反應器的操作模式應該是在將實驗資料與計算模型整合的基礎上所建立的，而不是在不斷試錯的基礎上所建立的。因此，將支架內流場分析和生物學實驗結果相結合，可以設計出更為高效的支架微結構或生物反應器，從而構建出更出色的工程化組織；與此同時，可基于計算機模擬來預測不同支架材料所需的最佳液流環境。因此，目前計算流體力學(CFD)在生物反應器設計和細胞培養要求等方面顯示出非常重要的意義，其數學建模涉及到流場、細胞生長、細胞外基質合成、流加灌注培養策略等許多內容，以達到維持最佳營養環境的目的。利用CFD可以分析生物反應器內流體的運動狀態及其流場特征等參數[22]、計算三維支架材料內部及表面的流體剪切應力、繪制氧分布圖；此外，還可依據培養基的流動速度與剪切力分布特性來推算培養物的生長狀態，進而優化生物反應器[23]。針對已投入使用和正在設計的組織工程皮膚灌流式生物反應器，胡信雷開展了數值模擬研究，結果發現：灌流式生物反應器的良好模式是圓柱形雙灌流模式。王瑞[24]利用CFD技術對灌注式培養器低速和高速流場的均勻性與剪切力進行模擬分析，發現低速(80 mL/min)條件下，營養液速度、動靜壓、流場旋渦度、速度梯度、流場矢量等指標能夠保證很好的均勻性。

綜上所述，隨著組織工程皮膚的不斷深入研究與迅速發展，生物反應器必將展現出其獨特的優勢，并引起廣泛關注。此外生物反應器的高速發展，也必將促進組織工程皮膚的進一步發展。研究表明，人工組織和器官的性能與質量取決于細胞培養和體外組織所構建的條件和環境是否解決體內細胞的實際發育情況。當前，生物反應器在組織工程皮膚中發揮了重要作用，但仍存在很多亟需解決的問題，如：①人體正常皮膚在組成、結構和功能等方面的高度復雜性對模擬細胞外基質成分的人工皮膚支架提出了更高的要求，如需要良好的生物活性、生物相容性和力學性能；②組織工程復合皮膚展現出了與正常人體皮膚相近的結構和功能，具備了正常皮膚的附屬器官，且可促進快速血管化(皮膚移植后)，并提高移植成功率。因此，組織工程復合皮膚是未來組織工程皮膚的重點發展方向；③今后組織工程皮膚領域中，所研制的生物反應器應滿足：氣液界面培養、低應力環境、低流速、均勻流場等基本要求外，又要具有良好的擴展性、比表面積大、功能更強等特性；生物反應器的傳質過程(尤其是氧的傳質)極大地限制了生物反應器的放大;④在生物反應器中進行高密度培養時，不均衡的溶氧傳質或許會成為制約組織工程皮膚生物反應器構建的關鍵因素。