抑制KLF8基因對CD133+肝癌干細胞亞群比例、裸鼠體內成瘤和肺轉移能力的影響

石軍梅，劉英，劉義冰，王曉翔，劉純一

(河北醫科大學第四醫院，石家莊 050000)

肝癌是我國發病率排名前五的惡性腫瘤，也是導致患者死亡的主要癌癥之一[1]。肝癌發病的危險因素包括乙肝、丙肝、酒精肝、脂肪肝、遺傳或基因突變等[2]。雖然肝癌的診療技術已取得了巨大的進步，但是因其具有復發、轉移率高及易耐藥等特點，仍缺乏有效的治療手段[3]，導致病死率居高不下。惡性腫瘤的發生發展與腫瘤干細胞(CSCs)密切相關，腫瘤的復發、轉移及治療耐藥均有CSCs的參與[4]。肝癌干細胞是CSCs的一種，具有自我更新、無限增殖、多向分化能力的細胞，是腫瘤無限生長的主要原因，也是惡性腫瘤發生復發、轉移及治療耐藥的根本原因[6,7]。目前，肝癌干細胞分選及鑒別的常用表面分子標志物有跨膜酪氨酸激酶受體蛋白(CD117、CD133、CD90、CD44)和上皮細胞黏附分子等，其中以CD133為分選標記，經流式細胞分選技術可分選出肝癌干細胞，該方法也是常用的肝癌干細胞識別、分選的方法[8,9]。KLF8基因是上皮間質轉化過程中的誘導蛋白，其表達與腫瘤的轉移和惡性進展密切相關，也可刺激和促進血管內皮生長因子分泌[10,11]。KLF8基因在肝癌組織中高表達，與肝癌的發生和惡性進展呈一定程度的正相關[12]。我們推測，通過慢病毒質粒敲除肝癌干細胞中KLF8基因的表達將可能抑制肝癌的惡性進展，但以往鮮有報道。本研究觀察了抑制KLF8基因表達對肝癌干細胞干性表型、體內成瘤及肺轉移能力的影響，以期為肝癌患者的復發、轉移或治療耐藥提供新的臨床治療思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 FITC標記的CD133抗人抗體及PE標記的對照抗體(BD，USA)，KLF8基因的干擾慢病毒載體質粒sh-KLF8及對照空載體質粒sh-control(GeneCopoeia構建，USA)，兔抗人KLF8抗體(CST，USA)，Lipofectamine 2000轉染試劑、TRIzol試劑(Invitrogen，USA)，RNA抽提試劑盒(Applied Biosystems，USA)，TaqMan逆轉錄試劑盒(Life Technologies，UK)，qSYBR-Green-containing PCR試劑盒(Qiagen，USA)，Dako兩步法免疫組化試劑盒(Dako，丹麥)。Multiskan Ascent酶標儀(Thermo，型號413MBY042078)，奧林巴斯倒置顯微鏡Olympus IX71(Olympus公司，日本，CCD圖像傳感器，配合Image-Pro Plus7.0成像系統使用)，紫外可見分光光度計(Thermo，Nanodrop 2000，USA)，BD FACSAriaTM流式細胞分選儀(BD，USA)。

1.2 原代肝癌細胞的分離及干細胞球的培養 ①肝癌肺轉移樣本收集及原代肝癌細胞分離：選取手術切除的肝癌肺轉移標本(經病理科確診)，將組織樣本于無菌體條件下迅速置于RNAlater保存液中，并立即保存于-80 ℃以用于后續實驗。該實驗的所有過程均遵從赫爾辛基宣言標準，該研究方案經我院倫理委員會批準，且在充分告知可能存在的風險后與該患者簽署了知情同意書。取人肝癌肺轉移標本約2.5 cm3，置于無菌培養皿內，漂洗2次，3 min/次，將組織剪成約1 mm3的小塊，加入1%膠原消化液消化0.5 h，將細胞懸液過0.45 μm的細胞篩，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清，共離心2次，上清液的重懸采用DMEM培養基。最后調整單細胞懸液的濃度為106個/mL，取3 mL單細胞懸液接種到25 mL的培養瓶內。每天顯微鏡下觀察干細胞球的形成情況，約2周后開始有細胞球形成，收集流式細胞儀分選出的CD133+表型的LCSCs，無血清懸浮擴大培養。②干細胞球培養：無血清培養基由DMEM-F12(1∶1)500 mL、B27(1∶50)10 mL、表皮生長因子(20 ng/mL)1 mL和堿性成纖維細胞生長因子(20 ng/mL)500 μL組成。經流式分選出的CD133+表型的肝癌干細胞均培養于含無血清培養基的低吸附六孔板中，細胞均置于37 ℃，飽和濕度，含5%CO2的細胞培養箱內孵育，每5 d加1.5 mL的新鮮培養基以補充干細胞生長所需的生長因子和營養，當干細胞球數量達到約200～300個時進行傳代。

1.3 KLF8基因RNA干擾重組慢病毒質粒的轉染及感染LCSCs KLF8基因RNA干擾重組慢病毒質粒的轉染 含KLF8基因干擾的重組慢病毒質粒(sh-KLF8)及其陰性對照慢病毒空載體質粒(sh-control)是由美國的GeneCopoeia公司構建(均帶egfp的熒光標簽)。將20 μg重組質粒，15 μg pCMV-delta R8，6 μg PLVX-AcGFP稀釋至500 μL雙蒸水，加入2×HBS 500 μL及50 μL氯化鈣，靜置0.5 h后滴入293T細胞培養液中，40 h后收集上清液，經離心微孔濾器過濾后分裝，病毒液-80 ℃保存。同法獲得對照質粒轉染后的病毒液。LCSCs感染：將兩種病毒液分別以病毒/細胞數量=18∶1的比例感染經流式分選鑒定的LCSCs，感染3 d后觀察熒光的表達量，并加入2.0 μg/mL的嘌呤霉素，繼續培養，直到所有細胞均可觀察到熒光的表達。

1.4 肝癌干細胞CD133+表型細胞亞群比例檢測 收集對數生長期的細胞進行細胞計數，將收集的細胞室溫下離心，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。PBS清洗細胞2次，1 000 r/min離心5 min，使用PBS調整細胞濃度至5×105，將調整濃度后的細胞平均分為兩份，分別將其移至流式管中，一份加入CD133-FITC抗體，一份中加入PE標記的對照抗體，各加入10 μL，分別加入阻斷劑20 μL，緩沖buffer 80 μL，將上述試劑充分混勻后，4 ℃條件下避光靜置15 min，將標記后的細胞離心，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗1次，棄上清，上機檢測CD133+表型細胞亞群的比例，上機分選出CD133+表型的肝癌干細胞細胞亞群，用于后續實驗。

1.5 RNA提取和qRT-PCR檢測 細胞經消化，離心，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入1 mL TRIzol，室溫孵育15 min，裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，按每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上孵育15 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，緩慢取上清，避免吸入中間層的白色物質，上層水相體積約為所用TRIzol試劑的60%，將吸取的上清置于另一干凈EP管內，加入等體積的異丙醇沉淀水樣中的RNA，顛倒混勻，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，見RNA沉淀附著于EP管，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，7 500 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μL無RNase水溶解，取1 μL測RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20 ℃保存備用。以上述提取的細胞總RNA為模板，按逆轉錄試劑盒說明書進行操作，逆轉錄生成cDNA，以cDNA為模板，按qSYBR-Green-containing PCR試劑盒的說明書進行操作，在BioRad IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統上檢測各組的Ct值并記錄。KLF8引物由Invitrogen公司合成，GAPDH為內參，KLF8的相對表達量用2-ΔΔCt來表征，ΔΔCt=(CtKLF8-CtGAPDH)target-(CtKLF8-CtGAPDH)control。反應體系為20 μL，每個樣設置3個復孔。

1.6 肝癌干細胞裸鼠體內成瘤能力及肺轉移能力觀察 ①體內成瘤能力：實驗用BALB/c免疫缺陷型裸鼠(SPF級)共10只，2～4周齡，雌性，體質量(20.3±2.7)g。飼養在恒溫(20～26 ℃)、恒濕(50%～56%)、無特定病原體的空氣潔凈層流架內，按SPF級動物飼養標準進行喂養。裸鼠分為LCSCssh-LIFR組和LCSCssh-control組，每組各5只，將構建的穩定干擾KLF8及其陰性對照肝癌干細胞株LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control分別經皮下注射到裸鼠體內，注射量為每只5×102，共100 μL。4周后處死裸鼠并解剖，取出瘤體，稱量瘤體的重量，該實驗的所有操作均符合動物倫理學。該實驗經我院倫理委員會批準且所有操作均符合動物倫理學。②肺轉移能力：實驗用BALB/c免疫缺陷型裸鼠(SPF級)共10只，實驗分LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control兩組(每組各5只)，將構建的穩轉細胞株LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control分別經尾靜脈注射到兩組裸鼠體內，注射量為每只1×102，共50 μL。4周后處死裸鼠并解剖，取出肺組織，HE染色，鏡下統計肺組織中所有轉移灶的個數。免疫組化法檢測肺轉移灶中KLF8蛋白，標本經甲醛固定后常規石蠟切片，經脫蠟及水化后常規免疫組化染色(按照Dako兩步法免疫組化試劑盒的說明書進行操作)，中性樹膠封片晾干，顯微鏡下采集200×的圖像，KLF8蛋白表達的定性研究采用直接觀察是否在細胞內表達(陽性著色為紅棕色)。

2 結果

2.1 肝癌干細胞的形態及感染結果 肝癌患者的肺轉移灶經體外分離、無血清懸浮培養及CD133+分選得轉移性LCSCs，鏡下觀察無血清懸浮培養下的LCSCs，發現LCSCs肝癌干細胞球圓而亮，生長狀態良好。分別穩定感染敲除KLF8基因及其陰性對照慢病毒質粒到LCSCs干細胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察到LCSCs干細胞的熒光表達情況，隨著感染時間的增加，LCSCs細胞中熒光的表達量不斷增加，最終熒光表達率均達90%以上時表明細胞株構建成功。qRT-PCR結果顯示，與LCSCssh-control細胞(1.032±0.031)比較，LCSCssh-KLF8干細胞(0.230±0.032)中KLF8 mRNA相對表達水平降低(P<0.05)。該結果進一步表明穩定敲除KLF8的LCSCssh-KLF8及其對照干細胞LCSCssh-control構建成功。

2.2 兩組CD133+表型細胞亞群比例比較 LCSCssh-control組和LCSCssh-KLF8組CD133+表型細胞亞群比例分別為54.71%±1.13%、1.03%±0.03%，兩組比較，P<0.05。

2.3 兩組裸鼠體內成瘤能力比較 LCSCssh-KLF8組和LCSCssh-control組裸鼠成瘤重量分別為(1.60±0.38)、(6.57±0.25)g，兩組比較，P<0.05。

2.4 兩組裸鼠體內肺轉移能力比較 LCSCssh-KLF8組和LCSCssh-KLF8組裸鼠肺轉移灶個數分別為(21.00±0.71)、(1.00±0.31)，兩組比較，P<0.05。

3 討論

肝癌是全球病死率排名第三，發病率排名第五的惡性腫瘤[13]。目前，肝癌的一線治療手段為肝移植或手術切除，但肝癌的易復發和轉移的特點使得一線治療常常對于該類患者并無明顯的效果，長期預后也不能令人滿意，晚期肝癌患者的二線治療常采用動脈化療栓塞或全身化療途徑，但由于肝癌腫瘤細胞易產生化學耐藥，且傳統化療藥物的毒性，常導致治療方案的療效有限及使用受限[14,15]。大量研究[16]顯示，腫瘤細胞中存在一小部分可維持腫瘤細胞異常生長的亞群，這群細胞具有無限增殖分裂和多向分化的能力，該類細胞被認為是導致腫瘤復發轉移的根本原因，這類細胞即為CSCs。因此，在肝癌復發和轉移患者的治療中，應該將肝癌CSCs作為腫瘤復發轉移治療的重要靶向細胞，尋找靶向CSCs的靶點，并對該靶點進行有效的干預將是治療肝癌腫瘤復發轉移的關鍵。

CD133蛋白是人類造血干/祖細胞中發現的一種5次跨膜糖蛋白，其表達特點為隨著細胞分化而迅速下調，該特點使CD133成為鑒定和分離CSCs的一個特異性分子標志[17]，CD133是肝癌、前列腺和黑素瘤等多種腫瘤的CSCs標志之一[18～20]。本實驗中我們通過從轉移性肝癌患者的肺轉移灶中分離并培養出原代細胞，經無血清懸浮培養形成肝癌轉移灶的腫瘤細胞球，以CD133為肝癌干細胞的分選標記，經流式細胞分選技術分選出CD133+表型的轉移性肝癌干細胞細胞亞群LCSCs，后經無血清懸浮培養法富集肝癌干細胞，該方法可行性高，富集的肝癌干細胞也較為可靠。

文獻[21,22,12]報道，KLF8在多種腫瘤中存在表達失調的現象，如KLF8在卵巢癌、乳腺癌、膠質瘤和肝癌的原發灶或轉移灶中均存在過表達的現象。在肝癌中KLF8的過表達與肝癌患者的疾病惡性程度或惡性進展如淋巴結陽性狀態、腫瘤分級增加、遠處轉移風險的增加及總體生存的降低等密切相關[23,24]。為了進一步挖掘KLF8及CSCs在肝癌復發轉移及治療耐藥中的作用，探究KLF8對肝癌干細胞干性表型及體內成瘤及肺轉移能力的影響，我們決定采用慢病毒質粒敲低肝癌干細胞中KLF8的表達，以觀察上述過程中的變化。通過轉染慢病毒質粒抑制KLF8的表達，篩選并成功構建了穩定抑制KLF8的穩轉甲狀腺癌干細胞株LCSCssh-KLF8及其對照干細胞株LCSCssh-control，鏡下觀察LCSCssh-KLF8和LCSCssh-control中細胞的熒光表達量，qRT-PCR法檢測細胞中KLF8 mRNA，我們也進一步驗證了該穩轉細胞株構建成功。

本研究顯示，敲除KLF8的確可以降低LCSCs肝癌干細胞中的CD133+表型細胞亞群的比例，減少裸鼠體內的成瘤重量和肺轉移灶的個數。該結果表明在肝癌干細胞中敲除KLF8可以降低代表肝癌干細胞干性表型的CD133，即抑制KLF8使肝癌干細胞的干性表型降低，降低肝癌干細胞的成瘤和肺轉移能力。對于敲低KLF8可降低干細胞干性表型、降低體內成瘤和肺轉移能力的原因，結合已有研究，由于多種腫瘤在復發及轉移的過程中，存在上皮間質轉化的現象，即存在上皮細胞向間質細胞轉化的過程，上皮間質轉化過程可顯著降低鈣黏蛋白(E-cadherin)介導的細胞間黏附，使細胞的上皮形態喪失，并獲得侵襲性更強的成纖維細胞樣的間質細胞表型，上皮間質轉化過程和E-cadherin的作用密切相關，E-cadherin功能缺失會使腫瘤細胞的侵襲和轉移能力增加，該過程使腫瘤細胞擁有干細胞特征、減少細胞的凋亡和衰老，并促進腫瘤細胞的免疫抑制[25,26]。在腫瘤發生的初期階段，上皮細胞經上皮間質轉化過程轉變為原位癌，后續腫瘤細胞經上皮間質轉化過程向周圍組織擴散，并經血管或淋巴管向遠處組織發生遷移，最終形成轉移灶[27,28]。而我們知道KLF8是上皮間質轉化過程中的誘導蛋白，KLF8可顯著抑制上皮間質轉化過程中的關鍵蛋白E-cadherin的表達，與E-cadherin蛋白的表達呈負相關，和細胞侵襲能力呈正相關[10,12]，另外KLF8也可顯著刺激和促進血管內皮生長因子的分泌，促進微血管的形成[11]。因此，我們推測敲低KLF8可降低干細胞干性表型、降低體內成瘤和肺轉移能力的具體原因，可能是因為敲低KLF8導致KLF8介導的上皮間質轉化過程和促進腫瘤微血管形成的過程被抑制而引起的。

總之，抑制KLF8可顯著抑制肝癌干細胞的干性表型和體內成瘤、肺轉移能力，因此研發靶向敲除KLF8的藥物將可能為復發轉移性肝癌的臨床治療提供新的思路。