基質金屬蛋白酶及其抑制劑在糖尿病皮膚創面愈合中作用的研究進展

馮潔，農曉琳

(廣西醫科大學口腔醫學院 廣西醫科大學附屬口腔醫院，南寧530021)

皮膚創面愈合功能受損是糖尿病并發癥之一，15%～25%的糖尿病患者會發生糖尿病足潰瘍(DFU)，長期不愈合者有高度截肢甚至死亡風險[1]。正常皮膚創面愈合是一個復雜且涉及高度精細事件的過程，包括止血、炎癥反應、增殖、肉芽組織形成、再上皮化、血管生成以及基質重塑。該過程中形成細胞外基質，促進傷口中細胞黏附、遷移和組織重塑等過程。創面愈合過程需要降解細胞外基質來控制，因此細胞外基質形成與降解過程之間的不平衡可能導致慢性潰瘍不愈。基質金屬蛋白酶(MMPs)屬于Zn2+依賴金屬蛋白酶超家族，能降解細胞外基質成分，參與創面愈合，炎癥期消除損傷的蛋白質和暫時性細胞外基質，在血管生成和細胞遷移的增殖期分解毛細血管基底膜，重塑期時能收縮和重塑組織；參與創面愈合中與免疫相關的控制過程、細胞遷移、血管生成，并通過作用于各種細胞外效應蛋白發揮作用，包括細胞因子、趨化因子、抗微生物肽、各種細胞表面蛋白質、甚至一些細胞外基質成分[2]。基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是MMPs的特異性抑制物，通過調節MMPs水平來調節其活性，能夠結合并可逆性阻斷MMPs活性。糖尿病皮膚創面難以愈合與MMPs和TIMPs的不平衡有關[3，4]。現將MMPs與TIMPs在糖尿病皮膚創面愈合過程中的作用綜述如下。

1 MMPs與TIMPs的分類

MMPs根據其底物特異性和細胞定位，可分為以下類型：①膠原酶：MMP-1、MMP-8、MMP-13及MMP-18；②明膠酶：MMP-2和MMP-9，催化域內有纖連蛋白Ⅱ型基序，使其能夠結合并降解明膠、膠原等；③間充質溶解素類：MMP-3、MMP-10和MMP-11；④MT-MMPs：MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24和MMP-25；⑤基質溶解素類：MMP-7、MMP-26，均沒有與血紅素結合蛋白序列；⑥其他：MMP-11、MMP-12、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP23A、MMP23B、MMP-27和MMP-28。TIMPs目前有四種亞型，TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。

2 MMPs在糖尿病皮膚創面愈合中的作用

2.1 膠原酶 在各種細胞培養和體外皮膚模型中，Ⅰ型膠原的角質形成細胞遷移依賴于MMP-1。研究發現，人體皮膚中的MMP-1切割Ⅰ型膠原，導致整合素α2β1親和力減弱，減輕了細胞運動的限制從而促進再上皮化[3]。但MMP-1過度表達不利于再上皮化，僅在創面遷移性上皮邊緣的基底角質形成細胞中表達，發生創傷會迅速增加，必須減少其過度表達以有利于再上皮化。Lobmann等[5]報道，相比于非糖尿病患者，DFU患者MMP-1高65倍，其機制可能是由于高蛋白水解環境導致糖尿病患者皮膚創面愈合不良。還有研究表明，與健康皮膚相比，1型糖尿病DFU角質形成細胞中MMP-1表達增加[6]。

MMP-8能有效切割Ⅰ型膠原，主要由中性粒細胞表達和儲存。一旦發生炎癥，中性粒細胞會滲透到組織中釋放和活化MMP-8[7]。Gooyit等[8]合成MMP-8抑制劑化合物21選擇性靶向抑制膠原酶MMP-8和MMP-12，結果顯示，db/db糖尿病小鼠與對照組相比創面延遲愈合，再上皮化減少，細胞凋亡增加，表明MMP-8在糖尿病創面愈合過程中發揮有利的作用。MMP-8在正常創面愈合中具有關鍵作用，但蛋白質的過度表達可能引起膠原過度分解、中性粒細胞延長炎癥期，從而導致創面延遲愈合。在慢性愈合創面中可檢測到MMP-8活性和水平增加。研究發現，相比于非糖尿病患者，DFU患者MMP-8明顯升高[6]。Chang[4]報道，在db/db糖尿病小鼠的創面中鑒定出活性MMP-8，與非糖尿病小鼠相比，db/db小鼠創面中活性MMP-8水平上調。

MMP-12能夠降解Ⅰ型膠原。研究發現，MMP-12敲除小鼠的成纖維細胞形成減少，創面收縮減小，與對照組相比，成纖維細胞的增殖和轉化生長因子β1誘導的肌成纖維細胞分化降低，表明MMP-13影響創面愈合中角質形成細胞的遷移、血管生成和收縮[9]。Ahmed等[10]建立糖尿病大鼠肌腱損傷模型，發現與糖尿病大鼠未受損肌腱相比，損傷肌腱中MMP-13表達增加，且愈合組織的血管細胞周圍觀察到MMP-13免疫反應性增加。Pincus等[11]建立雌激素缺乏的糖尿病創面模型，發現局部應用17β-雌二醇治療后MMP-13活性降低，創面愈合加速。

2.2 明膠酶 MMP-9能影響角質形成細胞遷移和上皮再生，在糖尿病損傷組織中表達增高，大量研究表明，過量的MMP-9是糖尿病皮膚創面愈合不良的預測因素[4，6，12，13]。當機體發生感染時，傷口中的巨噬細胞分泌一些炎癥調節劑作用于感染性刺激物，如IL-1β、TNF-α和IL-6，這些細胞因子均與MMP-9的活性有關[14]。Gooyit等[8]合成選擇性MMP-9抑制劑，發現MMP-9抑制劑局部治療db/db糖尿病小鼠創面，與對照相比愈合加速，再上皮化增多，細胞凋亡顯著減少，證實MMP-9活性升高導致創面難以愈合，使用選擇性MMP-9抑制劑有望干預治療糖尿病皮膚創面愈合。Singh等[15]研究表明，MMP-9基因表達異常是難愈性糖尿病性潰瘍的原因之一，與對照相比，糖尿病創面具有顯著的非甲基化MMP-9基因啟動子狀態，這可能是MMPs表達受損的結果。Li等[1]發現，DFU患者受損皮膚中的MMP-9水平高于健康患者和糖尿病患者的健康皮膚，且MMP-9上調程度與定植細菌數呈正相關，認為MMP-9在糖尿病創面中的上調和活動可能是高葡萄糖和晚期糖基化終產物誘導。Guillemin等[16]使用殼聚糖及硫酸軟骨素溶液加入Ⅰ型膠原制成的基質GBT013敷料作用于糖尿病小鼠慢性傷口模型，能夠降低MMP-9酶活性，改善糖尿病創面愈合。Henshaw等[17]在DFU局部應用蜂膠6周，與對照組相比，蜂膠組潰瘍面積減少，清創傷口處MMP-9降低，提示蜂膠能下調MMP-9，減少炎癥，改善糖尿病創面愈合。

MMP-2在糖尿病損傷中高表達。研究發現，高血糖可增加血管細胞中MMP-2活性，刺激細胞外基質降解并在糖尿病中引起失衡[5]。Krisp等[13]使用多維蛋白鑒定技術研究慢性DFU滲出物，發現MMP-2增高，對降解膠原蛋白和組織破壞具有顯著影響。Guillemin等[16]使用敷料GBT013作用于糖尿病小鼠慢性創面模型，發現其能夠抑制體外MMP-2酶活性，防止生長因子降解，促進細胞增殖，從而促進糖尿病創面愈合。

2.3 間充質溶解素類 MMP-3參與組織重塑，可能降解膠原原纖維，并激活其他MMPs，如MMP-1、MMP-7和MMP-9。已有研究發現，與受傷健康大鼠相比，糖尿病大鼠受損肌腱中MMP-3基因表達下調，提示MMPs表達改變影響基質蛋白降解和組織重塑，指出MMPs調節治療可能是糖尿病手術傷口新的再生愈合方法[10]。

MMP-10在體外可以降解彈性蛋白、非原纖維膠原蛋白、蛋白聚糖、明膠和酪蛋白，在創面邊緣表達。研究發現，嚴格調節MMP-10表達水平是創面部位基質降解的先決條件，進而控制角質形成細胞遷移[18]。López-López等[6]體外觀察到維生素D介導的DFU源角化細胞中MMP-10表達下調，認為MMP-10下調有助于糖尿病創面組織重建修復。

MMP-11常表達于皮膚創面愈合和基底細胞癌間質中。Hattori等[19]報道，松弛素能改善糖尿病小鼠創面愈合，其機制是通過增強MMP-11表達，促進調節膠原合成，減少愈合中不受控制的纖維化，維持細胞外基質的穩態。

2.4 膜型MMPs MMP-14位于細胞表面，切割細胞周圍的膠原纖維[20]，對創面愈合的生理病理過程至關重要。成纖維細胞中的MMP-14表達在成人皮膚膠原重塑中起關鍵作用，有助于纖維化皮膚病中真皮內穩態[21]。MMP-14還能與proMMP-2和TIMP-2形成復合物，激活MMP-2，復合物成分比例的任何變化可能導致基質降解變化。另外，MMP-14激活MMP-13，通過降解產生的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白調節創面愈合、血管生成和炎癥反應。Pincus等[11]局部應用17β-雌二醇治療雌激素缺乏的糖尿病創面，發現MMP-14活性降低，MMP-14表達降低不僅調節MMP-2和MMP-13活性，也減少基質降解，增加膠原含量，促進創面愈合。

2.5 基質溶解素類 MMP-26能切割纖連蛋白、玻連蛋白、纖維蛋白原、Ⅳ型膠原、明膠、α2-巨球蛋白和α1-蛋白酶抑制劑，還可激活proMMP-9，促進切割蛋白。研究發現，MMP-26在創面愈合的角質形成細胞中表達上調[22]。Piril?等[7]報道，慢性糖尿病創面中，MMP-26在上皮基底膜區域下方及皮下神經處都有表達，經過體外口腔黏膜角化細胞實驗，提示MMP-26對正常細胞遷移非常重要。但由于MMP-26在嚙齒動物中無法表達，還需人類標本進行更多病理生理學研究，探索MMP-26的作用機制。

3 TIMPs在糖尿病皮膚創面愈合中的作用

TIMP-1可在切除傷口和人類燒傷部位上皮細胞中檢測到，在傷口成纖維細胞尤其是血管周圍發生轉錄。Lao等[23]發現，糖尿病皮膚組織和糖基化終末產物處理的人成纖維細胞中TIMP-1的表達均顯著降低，采用活性蛋白TIMP-1處理人成纖維細胞后，發現活性蛋白TIMP-1有效促進細胞生長，減少細胞凋亡；采用TIMP-1載體介導基因治療糖尿病大鼠創面后，觀察到愈合明顯改善，提示TIMP-1促進糖尿病創面愈合。Ambrosch等[24]對8例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染患者的糖尿病足進行達托霉素抗感染治療，發現14 d后創面TIMP-1表達增加，創面面積收縮，提示達托霉素抗感染治療可通過增加TIMP-1表達促進愈合。Ayuk等[25]采用660或830 nm激光照射體外培養的糖尿病患者皮膚成纖維細胞，8 h后發現TIMP-1表達增加，提示激光照射可增加TIMP-1表達，減少基質降解，促進糖尿病創面愈合。Guillemin等[16]使用GBT013敷料提高糖尿病小鼠慢性創面中TIMP-1的表達，有助于創面愈合中組織重塑。

4 MMPs/TIMPs比值與糖尿病皮膚創面愈合的關系

MMP-9是正常創傷愈合過程中的主要膠原酶，其過度表達和激活可能導致糖尿病慢性難愈合性下肢潰瘍。TIMP-1可結合并抑制MMP-9活性，MMP-9/TIMP-1平衡影響著DFU創面愈合。過高的MMP-9/TIMP-1比值與DFU的潰瘍愈合及創面閉合率呈負相關[7]。Li等[26]報道，MMP-9/TIMP-1比值過高提示創面愈合不良，MMP-9/TIMP-1比值可作為入院治療前評估糖尿病創面愈合情況的預測指標。另外，Li等[1]對32例糖尿病患者DFU取皮膚活檢并行微生物培養，發現MMP-9/TIMP-1比值升高，VEGF表達降低，表明MMP-9/TIMP-1比值過高可能通過降低VEGF表達抑制糖尿病皮膚創面愈合；同時他們發現，感染的DFU組TIMP-1表達降低，其原因可能是由于高葡萄糖條件下，成纖維細胞減少TIMP-1表達、增加MMP-9表達，此外細菌可以誘導炎癥細胞因子如IL-4和IL-6分泌，其過度活化可以減少TIMP-1。

MMPs及TIMPs在糖尿病皮膚創面愈合中的作用十分復雜，盡管有大量文獻報道，但由于蛋白酶家族過多成員及補償機制，至今尚未完全闡明它們的影響機制。全面分析MMPs及TIMPs在糖尿病皮膚創面愈合發生發展中的進展機制，對于臨床模擬MMPs抑制劑作用控制相關MMPs及細胞因子改善創面愈合有重要意義。