miRNAs與血管新生關系的研究進展

鄒燕，肖凱強，何雪梅，周陽，周翔宇

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000；2自貢市第四人民醫院；3西南醫科大學)

近年來，腫瘤、糖尿病等血管異常增生性疾病和冠心病、心肌梗死、腦梗死等缺血性心腦血管疾病的發病率和致殘率逐年升高，嚴重危害人類健康。在以心肌梗死、腦梗死為主的缺血性心腦血管疾病方面，血管新生是血管重構的必要環節，通過外源途徑的治療性血管新生為缺血性疾病的攻克帶來了新的希望。而腫瘤的轉移和生長是一個依賴血管的過程，其生長主要依賴新生血管的形成，因此以抑制血管新生為靶點對腫瘤進行生物治療已成為近年研究的熱點。血管新生指在原有毛細血管和(或)微靜脈基礎上通過血管內皮細胞增殖和遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生的形式生成新的毛細血管。血管新生的過程受到促進血管生成因子和抑制血管生成因子的調控，涉及內皮細胞的增殖、遷移、小管形成等細胞功能。研究顯示，血管新生的過程可受微小RNA(miRNAs)的調控。研究證實，miRNAs可調節血管生成相關因子的表達，調控內皮細胞增殖、遷移和管形成，最終影響血管新生[1～3]。本文主要從促進血管新生和抑制血管新生兩方面概述miRNAs在血管新生方面的最新研究進展。

1　miRNAs與血管新生的關系

miRNAs是一種約22個核苷酸組成的內源性非編碼RNA，主要通過結合信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(UTR)來對靶基因進行轉錄后調控，完成一些生理學過程或信號通路調節，最終降解mRNA或抑制特定蛋白質的翻譯。miRNAs負性調控基因的表達，調控體內超過30%的基因表達，與細胞增殖、分化、凋亡、胚胎發育、組織器官等形成以及多種疾病的發生發展密切相關。這為miRNAs成為血管新生相關疾病的生物治療提供了理論依據。自Kozomara等[4]在秀麗新小桿線蟲中首次發現lin-4以來，迄今在超過140類物種中發現逾15 000種miRNAs，在人體內也發現超過1 400種。研究提示，miRNAs與血管新生之間聯系緊密，血管特異性miRNAs是血管新生的關鍵調節基因之一。Voellenkle等[5]首次應用第3代測序技術，即基于納米孔的單分子讀取技術，分別在組織正常氧含量及缺氧條件下，發現靜脈內皮細胞(HUVECs)中有超過400余種miRNAs表達，并且兩者表達水平存在一定差異，進一步證實缺氧誘導miRNAs表達異常，從而調控內皮細胞分化，參與血管新生。近期研究表明，參與血管新生的miRNAs大致可分為促血管新生的和抑制血管新生的，但也有少量miRNAs對血管新生的作用表現出雙重性，比如HUVECs中的miR-21-5p，在常氧條件下上調hsa-miR-21-5p可促進血管新生，在缺氧條件下卻表現出抑制血管新生的特性[6]。

2　抑制血管新生的miRNAs

2.1　靶基因為血管內皮生長因子(VEGF)家族的miRNAs

在一系列血管生成誘導劑中，VEGF可能是最重要的因素[7]。VEGF是一種可特異性促進血管內皮細胞生長的蛋白質，其作為血管內皮細胞的特異性有絲分裂原，在體內體外均可特異性促進血管內皮細胞生長和誘導血管生成。VEGF主要有兩種受體表達于內皮細胞，分別為血管內皮生長因子受體-1(VEGFR-1)和血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)[8]。內皮細胞在病理性血管生成的每一步都起到了舉足輕重的作用，包括細胞遷移、增殖、侵襲、黏附、管形成[9]。一般情況下，在內皮細胞中VEGF結合到VEGFR可激活細胞內幾種信號分子，比如磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)，最終促進血管生長和成熟[10]。在內皮細胞中調節細胞遷移、增殖、生長的信號通路主要是PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK信號通路，激活這些通路可調控血管新生。Jin等[11]報道，VEGF誘導脈絡膜內皮細胞增殖和管形成涉及PI3K-Akt和Raf/MEK/ERK信號通路，最終這兩條通路都會影響VEGF表達。

近期研究表明，miRNAs可通過影響VEGF表達，從而間接影響這些信號通路的過程，最終調控血管新生。在大鼠大腦中動脈閉塞模型中和體外缺氧誘導的HUVECs中，miR-195、miR-140-5p、miR-150表達顯著降低，VEGF或血管內皮生長因子A(VEGFA)表達顯著增加；上調miR-195、miR-140-5p、miR-150水平可抑制內皮細胞增殖、遷移和管形成從而抑制血管新生，下調可增強內皮細胞功能、促進血管新生，它們的靶基因為VEGF或VEGFA[2，12，13]。miRNAs不僅可通過影響VEGF表達影響血管新生，還可通過影響VEGFR表達影響血管新生。研究[14]表明，對于腫瘤的血管新生而言，VEGFR-2是最重要的VEGFR。Tu等[1]采用MTT實驗和TUNEL實驗檢測miR-497對HUVECs增殖和凋亡的影響，Western blotting法檢測miR-497的下游靶點，此外，為了揭示miR-497對血管生成的作用，用活體生物發光成像法監測采用miR-497模擬物處理VEGFR-2轉基因小鼠后的腫瘤血管生成和腫瘤生長情況，結果表明，在體內和體外過表達miR-497均顯示出了對VEGFR-2活化和下游Raf/MEK/ERK信號通路的抑制作用，過表達miR-497通過抑制靶基因VEGFR-2和下游PI3K/AKT信號通路能夠有效誘導HUVECs凋亡。Tu等[1]報道，miR-497在EGFR2Luc乳腺腫瘤模型中具有抗血管新生和抗癌的作用。

2.2　靶基因為內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的miRNAs

eNOS對內皮損傷具有重要的調控作用，通過調節一氧化氮(NO)的產生從而調控血管的壓力和穩態，如果這個調節機制失調將會導致血管內皮功能受損[15]。近期研究顯示，一些天然化合物可通過調節eNOS的產生從而影響血管新生。Chan等[16]利用miRNA微陣列分析發現，人參皂苷Rg1處理后的HUVECs中有17個miRNAs(包括miR-214)下調和5個miRNAs上調，下調miR-214水平可促進HUVECs的eNOS表達、遷移和管形成，上調miR-214水平反而抑制HUVECs的eNOS表達、遷移和管形成。Kim等[17]認為，腫瘤壞死因子α可有效抑制HUVECs增殖和遷移，然而這種功效可被miR-155拮抗劑有效逆轉，上調miR-155表達可通過抑制靶基因eNOS最終抑制HUVECs增殖、遷移和管形成。

2.3　其他靶基因的miRNAs

抑制血管新生的miRNAs為其他靶基因的主要有miR-221/miR-222、miR-29b、miR-29c等。近期研究表明，miR-221/miR-222是較明確的能抑制血管形成的miRNAs，miR-221和miR-222編碼基因位于X性染色體p11.3相近位置，屬于同一家族，調控相同的靶基因，兩者互相協調發揮作用，且抑制血管新生的途徑有很多。有研究[18]發現，基因敲除斑馬魚體內的miR-221，可激活下游細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B和磷酸肌醇3激酶調節亞基1通路，最終促進血管新生，表明miR-221在內皮細胞增殖、遷移和血管新生中具有關鍵調節作用。干細胞因子(SCF)是刺激HUVECs增殖、遷移及毛細血管狀結構形成的重要影響因素。miR-221/miR-222抑制血管新生的主要機制是下調SCF受體c-kit表達，而不影響SCF的mRNA水平，屬于轉錄后調節[18，19]。PI3K/AKT通路是血管新生過程中的經典信號通路，miR-492和miR-29c通過負性調控其靶基因SP1、PDPK和IGF-1調節PI3K/AKT信號通路，不僅可以直接抑制eNOS的表達和活性，還可抑制內皮細胞增殖、遷移、血管生成[20，21]。miRNAs不但可以直接靶向調節VEGF，還可通過其靶基因調節VEGF表達。miR-7是抑制血管新生的miRNAs，KLF4是miR-7的直接靶點和VEGF的轉錄激活因子，下調miR-7可促進HUVECs的管形成，同時伴隨VEGF、KLF4蛋白和mRNA表達水平的上調，表明抑制miR-7可通過直接干預靶基因KLF4和上調VEGF促進血管新生，提示miR-7-KLF4-VEGF信號軸在調節HUVECs血管新生中發揮重要作用[22]。Liu等[23]報道，過表達miR-451可顯著抑制肝癌細胞促進HUVECs增殖、遷移和管形成的作用，在裸鼠中過表達miR-451也可抑制腫瘤生長和血管形成，miR-451通過靶向IL-6R-STAT3信號通路抑制肝細胞癌中VEGF產生和IL-6R-STAT3-VEGF信號通路，最終抑制肝細胞癌的血管新生。這些結果提示，這類miRNAs不僅抑制腫瘤細胞的生長，還可抑制腫瘤的血管新生，有望成為治療腫瘤的新型生物制劑。

3　促進血管新生的miRNAs

目前發現的促進血管新生的miRNAs主要有miR-126、miR-378、miR-132、miR-146a、miR-31、miR-425-5p、let-7f等。miR-126是一種內皮細胞特異性miRNAs。miR-126不僅可調控內皮細胞中大多數的VEGFA，還可以單獨調節血管生成和血管的完整性，在miR-126敲除的細胞中，VEGFA介導ERK、Akt磷酸化的減弱表明miR-126涉及SPRED1、PIK3R2調節的VEGFA通路[25]。miRNAs不僅能夠通過影響VEGF表達調節血管新生，而且VEGF影響血管新生的機制也涉及miRNAs。VEGF通過激活Akt、Erk信號通路上調miR-31和miR-20a的表達，從而抑制腫瘤壞死因子超家族-15(TNFSF15)的產生，最終促進血管新生，在體外血管生成試驗中，上調HUVECs miR-31和miR-20a表達可促進管形成，下調miR-31和miR-20a可抑制管形成[26]。在另一項研究[27]中，將帶有轉染了miR-378的癌細胞注射到裸鼠中，發現注射了轉染miR-378癌細胞的裸鼠腫瘤血管比注射只轉染熒光癌細胞的裸鼠更多、更大，證明miR-378可促進血管新生。

最近研究提出，miRNAs可作為一種內分泌遞質調控血管新生。脂肪干細胞分泌含有大量miR-31的囊泡，miR-31可通過靶基因缺氧誘導因子(一種抗血管生成基因)促進HUVECs遷移、小管形成、小鼠主動脈微血管生長和血管形成[28]。生活中的有害物質(比如飲用水砷污染、香煙煙霧等)影響人類健康，促使人類易患心血管疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化和微血管病變，這些患病機制可能與miRNAs調控血管新生有關。let7簇在HUVECs中廣泛表達，let-7f是一種促血管生成的miRNAs，在香煙煙霧提取物處理的HUVECs和在暴露于香煙煙霧的小鼠的缺血肌肉中，let-7f表達顯著降低；在香煙煙霧提取物處理的HUVECs中過表達let-7f可促進細胞黏附、增殖、遷移、管形成；在暴露于香煙煙霧后的小鼠后肢缺血模型中注射let-7f模擬物可促進血流回復和血管新生[29]。Gao等[3]研究顯示，亞砷酸鈉(NaAsO2)可減少HUVECs增殖、遷移和成管能力，從而抑制血管新生；NaAsO2處理之后miR-425-5p在體內和體外的表達均降低，并且過表達miR-425-5p可直接控制靶基因CCM3從而逆轉NaAsO2誘導的抗血管生成的作用；miR-425-5p阻斷NaAsO2誘導的抗血管生成的機制涉及Notch信號通路的抑制和VEGF/p38信號通路的激活。其他的促血管新生的miRNAs還有miR-132、miR-146a、miR-210、miR-424等[30]。

4　miRNAs作為調節血管新生的生物制劑

因為miRNAs在信號通路上具有同時調控多個基因的潛力，并且體積小、物種間序列保守性強、相對穩定，故可作為一種很有前景的調控血管新生的生物治療方法。兩種常見的靶向miRNAs主要包括miRNAs模擬物和miRNAs拮抗劑。雖然miRNAs作為治療靶點有一些優勢，但是要想將其應用到臨床上必須面對諸多挑戰，比如非靶效應、組織特異性傳遞、細胞攝取并發癥以及體內不穩定性。在1型糖尿病小鼠后肢缺血模型中miR-29a的表達下調，通過敲除miR-29a可促進小鼠缺血區的血流灌注[31]。有關角膜血管新生的研究中，在視網膜缺血引起的脈絡膜新生血管形成過程中miR-31、miR-150、miR-184表達降低，而它們在角膜和晶狀體的表達水平很高，提示這些組織的無血管特性可能與這些miRNAs具有很強的抗血管新生活性有關，這三個miRNAs的靶基因編碼促血管新生的靶蛋白是血小板源性生長因子B、缺氧誘導因子1α和VEGF；通過小鼠眼內注射miR-31、miR-150、miR-184可顯著減少視網膜脈絡膜新生血管。盡管miRNAs在體外血管新生研究中已取得較滿意的結果，但目前對血管新生生物治療的研究仍處于臨床前實驗階段或臨床前期階段，將miRNAs作為調控血管新生生物制劑應用到臨床還需較長時間，還需要進行大量的研究來發現完整的調控血管生成的miRNAs網絡，不遠的將來，靶向miRNAs可能成為治療血管生成相關疾病的潛在候選藥物。

5　展望

盡管目前對于miRNAs參與血管新生的調控機制研究已經取得了一定結果，但是大部分文獻是從miRNAs的下游調控血管新生研究的，而有關miRNAs的上游參與血管新生的機制研究甚少。在有關動物模型血管新生的研究中，由于個體的差異性、miRNAs的多靶基因調節性和一個靶基因可受多個miRNAs的調節，降低了miRNAs在動物缺血模型中的作用效果。目前miRNA與血管新生的研究主要圍繞將miRNAs作為疾病診斷的標志物和靶向治療兩個方面，尚無統一的精準定義哪些miRNAs作為血管新生的標志分子。尋找有效的生物標志物將有助于更好地了解血管新生的相關機制，從而找到疾病更好的治療方法。在不遠的將來，以miRNAs為基礎的血管新生療法將為臨床腫瘤、心血管疾病患者帶來福音。

參考文獻：

[1] Tu Y, Liu L, Zhao D, et al. Overexpression of miRNA-497 inhibits tumor angiogenesis by targeting VEGFR2[J]. Sci Rep, 2015,5(1):13827-13839.

[2] Sun J, Tao S, Liu L, et al. miR-140-5p regulates angiogenesis following ischemic stroke by targeting VEGFA[J]. Mol Med Rep, 2016,13(5):4499-4505.

[3] Gao Y, Yin Y, Xing X, et al. Arsenic-induced anti-angiogenesis via miR-425-5p-regulated CCM3[J]. Toxicology Letters, 2016,254:22-31.

[4] Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data[J]. Nucleic Acids Res, 2011,39(Database issue):152-157.

[5] Voellenkle C, Rooij J, Guffanti A, et al. Deep-sequencing of endothelial cells exposed to hypoxia reveals the complexity of known and novel microRNAs[J]. RNA, 2012,18(3):472-484.

[6] Chang CH, Yen MC, Liao SH, et al. Dual role of mir-21-mediated signaling in huvecs and rat surgical flap under normoxia and hypoxia condition[J]. Int J Mol Sci, 2017,18(9):1917-1929.

[7] Amini A, Masoumi Moghaddam S, Morris DL, et al. The critical role of vascular endothelial growth factor in tumor angiogenesis[J].Curr Cancer Drug Targets, 2012,12(1):23-43.

[8] 齊鵬鵬,于士洋,吳梓齊,等.血管內皮生長因子的研究進展[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2016,26(6):381-384.

[9] Coultas L, Chawengsaksophak K, Rossant J. Endothelial cells and VEGF in vascular development[J]. Nature, 2005,438(7070):937-945.

[10] Hata Y, Miura M, Nakao S, et al. Antiangiogenic properties of fasudil, a potent Rho-Kinase inhibitor[J]. Jpn J Ophthalmol, 2008,52(1):16-23.

[11] Jin J, Yuan F, Shen MQ, et al. Vascular endothelial growth factor regulates primate choroid-retinal endothelial cell proliferation and tube formation through PI3K/Akt and MEK/ERK dependent signaling[J]. Mol Cell Biochem, 2013,381(1-2):267-272.

[12] He QW, Li Q, Jin HJ, et al. MiR-150 regulates poststroke cerebral angiogenesis via vascular endothelial growth factor in rats[J]. CNS Neurosci Ther, 2016,22(6):507-517.

[13] Zhao WJ, Zhang HF, Su JY. Downregulation of microRNA-195 promotes angiogenesis induced by cerebral infarction via targeting VEGFA[J]. Mol Med Rep, 2017,16(4):5434-5440.

[14] Chatterjee S, Heukamp LC, Siobal M, et al. Tumor VEGF:VEGFR2 autocrine feed-forward loop triggers angiogenesis in lung cancer[J]. J Clin Invest, 2013,123(4):1732-1740.

[15] Siragusa M, Fleming I. The eNOS signalosome and its link to endothelial dysfunction[J]. Pflugers Arch, 2016,468(7):1125-1137.

[16] Chan LS, Yue PY, Mak NK, et al. Role of microRNA-214 in ginsenoside-Rg1-induced angiogenesis[J]. Eur J Pharm Sci, 2009,38(4):370-377.

[17] Kim J, Lee KS, Kim JH, et al. Aspirin prevents TNF-alpha-induced endothelial cell dysfunction by regulating the NF-kappaB-dependent miR-155/eNOS pathway: role of a miR-155/eNOS axis in preeclampsia[J]. Free Radic Biol Med, 2017,104:185-198.

[18] Nicoli S, Knyphausen CP, Zhu LJ, et al. miR-221 is required for endothelial tip cell behaviors during vascular development[J]. Dev Cell, 2012,22(2):418-429.

[19] Poliseno L, Tuccoli A, Mariani L, et al. MicroRNAs modulate the angiogenic properties of HUVECs[J]. Blood, 2006,108(9):3068-3071.

[20] Patella F, Leucci E, Evangelista M, et al. MiR-492 impairs the angiogenic potential of endothelial cells[J]. J Cell Mol Med, 2013,17(8):1006-1015.

[21] Yun H, Feng D, Jinlin S, et al. Evaluation of miR-29c inhibits endotheliocyte migration and angiogenesis of human endothelial cells by suppressing the insulin like growth factor 1[J]. Am J Transl Res, 2015,7(3):489-501

[22] Li YZ, Wen L, Wei X, et al. Inhibition of miR-7 promotes angiogenesis in human umbilical vein endothelial cells by upregulating VEGF via KLF4[J]. Oncol Rep, 2016,36(3):1569-1575.

[23] Liu X, Zhang A, Xiang J, et al. miR-451 acts as a suppressor of angiogenesis in hepatocellular carcinoma by targeting the IL-6R-STAT3 pathway[J]. Oncol Rep, 2016,36(3):1385-1392.

[24] Kuehbacher A, Urbich C, Zeiher AM, et al. Role of Dicer and Drosha for endothelial microRNA expression and angiogenesis[J]. Circ Res, 2007,101(1):59-68.

[25] Fish JE, Santoro MM, Morton SU, et al. miR-126 regulates angiogenic signaling and vascular integrity[J]. Dev Cell, 2008,15(2):272-284.

[26] Deng HT, Liu HL, Zhai BB, et al. Vascular endothelial growth factor suppresses TNFSF15 production in endothelial cells by stimulating miR-31 and miR-20a expression via activation of Akt and Erk signals[J]. FEBS Open Bio, 2017,7(1):108-117.

[27] Lee DY, Deng Z, Wang CH, et al. MicroRNA-378 promotes cell survival, tumor growth, and angiogenesis by targeting SuFu and Fus-1 expression[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(51):20350-20355.

[28] Kang T, Jones TM, Naddell C, et al. Adipose-derived stem cells induce angiogenesis via microvesicle transport of miRNA-31[J]. Stem Cells Transl Med, 2016,5(4):440-450.

[29] Dhahri W, Dussault S, Haddad P, et al. Reduced expression of let-7f activates TGF-beta/ALK5 pathway and leads to impaired ischaemia-induced neovascularization after cigarette smoke exposure[J]. J Cell Mol Med, 2017,21(9):2211-2222.

[30] 石曉鳳,張俊峰.微小RNA對血管新生的調控機制研究進展[J].醫學綜述,2013,19(20):3664-3666.

[31] Chen L, Okeke E, Ayalew D, et al. Modulation of miR29a improves impaired post-ischemic angiogenesis in hyperglycemia[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2017,242(14):1432-1443.