聚乙烯亞胺對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞TNF-α表達的影響

張敏，魏萌，李懔，李金玉

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院，江蘇淮安223300)

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征，是危重患者的主要致死原因。膿毒癥最常見的致病菌為革蘭陰性菌，膿毒癥患者病理生理學的變化與革蘭陰性菌所產生的內毒素所致的感染反應有重要關系。對于膿毒癥的治療，雖然采用抗菌藥物及其他強力支持性措施，但由于一般不能有效中和、滅活內毒素毒性或抑制其誘生的多種活性介質，因此難以從根本上解決其防治問題。嚴重膿毒癥患者的病死率達25%～30%，發生膿毒性休克后，患者病死率高達50%～60%[1，2]。研究發現，內毒素是革蘭陰性菌細胞壁的最外層結構，其主要化學成分為脂多糖(LPS)。LPS是由類脂、多糖、蛋白質組成的復合物，在膿毒癥的病理演變中具有極其重要的作用。LPS因富含磷酸基團及羥基，在溶液中帶有負電荷[3～5]。聚乙烯亞胺(PEI)是最早用于基因轉染的陽離子聚合物之一，PEI分子內含有許多氨基，在生理pH下會發生質子化，從而帶有正電荷，可以通過靜電作用與帶負電荷的物質結合。已有文獻報道，富陽離子的PEI能夠與LPS結合，并且能夠吸附液體內游離的LPS[6，7]。2015～2016年，我們采用LPS刺激巨噬細胞產生炎癥反應，觀察PEI對炎癥反應的影響。

1　材料與方法

1.1　材料

小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞(Abelson鼠科白血病病毒誘導的白血病小鼠腹水中提取的單核巨噬細胞)購于武漢大學，PEI-B25(美國Sigma公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；氯仿(國藥集團化學試劑有限公司)；異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；LPS(美國Sigma公司)；焦炭酸二乙酯(美國sigma公司)；Alexa-LPS(美國Invitrogen公司)；DMEM高糖(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Giboco公司)；兩步法RT-PCR試劑盒(Takara Biotechnology)；引物(Takara Biotechnology)；TNF-α ELISA檢測試劑盒(中國欣博盛公司)。

1.2　細胞培養與干預

將RAW264.7細胞加入含10%胎牛血清的高糖培養基、5% CO2、37 ℃條件下傳代培養。取生長狀態良好的細胞，接種于6孔板內，每個板內細胞數約3×105/mL，每個孔內含1.5 mL培養基。生長過夜后，將細胞分為空白組、LPS組、LPS+PEI組。空白組用相同體積的培養基孵育細胞；LPS組加入10 ng/mL LPS，LPS+PEI組先加入10 ng/mL LPS，培養10 min后加入1 μg/mL PEI。

1.3　細胞內TNF-αmRNA表達檢測

采用real-time PCR法。用TRIzol法提取細胞內總RNA，并檢測其純度和濃度。以總RNA為模板，逆轉錄合成第一鏈cDNA，特異性引物分別擴增TNF-α和β-actin。TNF-α引物序列：上游5′-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3′，下游5′-GCTCCTCCACTTGGTGGTTT-3′；β-actin引物序列上游5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。將得到的逆轉錄反應液加入到real-time PCR反應體系中，配制10×反應體系(即0.2 μL ROX，0.2 μL SYBR，0.2 μL引物前鏈，0.2 μL引物后鏈，3.4 μL水和1 μL cDNA)。將配好的反應體系在PCR儀器上進行擴增，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共循環40次。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以β-actin為內參，TNF-α mRNA的相對表達水平由公式2-ΔΔCt進行計算。

1.4　細胞上清液中TNF-α水平檢測

采用ELISA法。各組細胞培養4 h后，取上清液，按照ELISA試劑盒的說明，檢測各組上清內TNF-α。按照操作說明書配制不同濃度的標準品、生物素化抗體工作液和稀釋液、酶結合物工作液和稀釋液、PBS洗滌液。分別設空白孔、標準孔、待測樣本孔。在空白孔中加樣本通用稀釋液100 μL，其余相應孔中分別各加入100 μL不同濃度的標準品和所檢測的標本。36 ℃孵箱內孵育90 min。PBS液洗板5次后，在空白孔內加生物素化抗體稀釋液(100 μL/孔)，其余孔中各加入100 μL生物素化抗體工作液，36 ℃孵箱內孵育60 min。PBS液體洗板5次后，空白孔中加入酶結合物稀釋液(100 μL/孔)，其余孔內各加入100 μL酶結合物工作液，用封板膠封住反應孔，孵箱內36 ℃孵育30 min。PBS液體洗板5次后，每孔內加入顯色底物(TMB)100 μL，放入36 ℃孵箱內避光孵育15 min。每孔內加入100 μL終止液，混勻后即刻用酶標儀測量OD450值。

1.5　RAW264.7細胞對Alexa-LPS的吸附情況觀察

取生長狀態良好的RAW264.7細胞，分為Alexa-LPS組和Alexa-LPS+PEI組。Alexa-LPS組加入10 ng/mL Alexa-LPS；Alexa-LPS+PEI組加入10 ng/mL Alexa-LPS培養10 min后，再加入1 μg/mL PEI。孵育30 min后，棄培養基，加入PBS清洗，低溫離心5 min；棄上清液，加入200 μL PBS，制成細胞懸液，上流式細胞儀檢測兩組細胞的平均熒光光度值。

1.6　統計學方法

2　結果

2.1　各組細胞內TNF-α mRNA表達水平比較

空白組、LPS組、LPS+PEI組細胞內TNF-α mRNA表達水平分別為0.99±0.14、50.79±7.44、38.77±5.24。LPS組TNF-α mRNA表達水平較空白組升高(P<0.01)，LPS+PEI組較LPS組降低(P<0.05)。

2.2　各組細胞上清液中TNF-α水平比較

空白組、LPS組、LPS+PEI組細胞上清液中TNF-α水平分別為6.68±2.99、1 085.00±236.20、753.10±61.46。LPS組TNF-α水平較空白組升高(P<0.01)，LPS+PEI組較LPS組降低(P<0.05)。

2.3　LPS組和LPS+PEI組細胞平均熒光光度值比較

LPS組和LPS+PEI組的細胞平均熒光光度值分別為221.0±11.2、228.0±8.2，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3　討論

內毒素的生物學活性多種多樣，在體內的作用錯綜復雜，參與了機體內許多病理生理反應過程。內毒素進入機體后，主要由單核/巨噬細胞識別、吸附。據報道，給大鼠靜脈注射放射性標記的內毒素后5 min，99%以上的內毒素即迅速從循環中清除。免疫組化結果顯示，從循環中清除的內毒素迅速分布到肝、肺、腎等組織的巨噬細胞內。內毒素及其代謝產物經巨噬細胞代謝后可逐漸由膽道系統排泄。所以說，單核/巨噬細胞在膿毒癥的發生發展過程中發揮了極其重要的作用[8]。

內毒素進入機體內，對機體所造成的影響主要包括以下幾個方面：①細胞水平：刺激單核/巨噬細胞、內皮細胞和白細胞等炎癥細胞合成、釋放一系列炎癥介質，導致機體炎癥反應失衡，從而造成細胞組織器官損傷。②免疫系統：導致固有免疫細胞和適應性免疫細胞如CD4、CD8、T細胞、B細胞和樹突狀細胞數量下降，細胞上抑制性受體(如程序性細胞死亡受體)表達增多，同時抑制性細胞(如調節性T細胞和髓源性抑制性細胞)明顯升高。③凝血系統：激活凝血、纖溶系統，觸發彌散性血管內凝血(DIC)等反應。④病理生理改變：發熱反應、血壓降低、代謝改變和局部過敏反應等[9]。目前認為，這些效應主要是由于LPS與巨噬細胞表面的受體結合后產生的刺激作用，促使炎癥信號由細胞外轉入細胞內，導致細胞合成、釋放大量細胞因子及炎癥介質，從而造成機體內炎癥反應失衡。

LPS是由類脂、多糖、蛋白質組成的復合物，在結構上分成三部分：外層為O-特異性多糖鏈，為細菌的特異性抗原；中層為核心多糖，為細菌的共同的抗原；內層為類脂A，主要決定LPS的致病性，是LPS的生物活性中心。LPS在LPS結合蛋白LBP的運輸下與CD14結合。CD14是一種55 kD的富含亮氨酸重復序列的糖蛋白，其在N端有一疏水口袋，該疏水口袋邊緣富陽離子殘基，能容納磷酸化的脂質A，從而與LPS結合。CD14是GPI錨定蛋白，并沒有細胞質內組分。為了將LPS信號轉導入細胞內，CD14將LPS運送到TLR4-MD-2復合物，LPS促進TLR4-MD-2復合物二聚體的形成，進而促進細胞內信號的進一步傳導；LPS刺激RAW264.7細胞后，導致大量促炎因子的產生，如TNF-α、IL-6等，其中有代表性的就是TNF-α。大量炎癥介質的產生會對機體造成損傷，出現膿毒性休克甚至死亡[10～13]。在炎癥早期積極地應用抗炎藥物，能夠抑制RAW264.7細胞的促炎反應，從而在一定程度上抑制全身炎癥反應綜合征。所以，對嚴重膿毒癥或膿毒性休克更需要早期認識、早期診斷，并在診斷明確后立即治療，只有這樣才能改善預后[14，15]。

PEI是富陽離子的聚合物，常用于基因轉染、免疫佐劑、基因疫苗運輸工具，能夠與LPS結合，吸附液體內游離的LPS[16,17]。本研究結果顯示，LPS刺激巨噬細胞后，TNF-α在mRNA和蛋白水平均明顯升高，應用PEI干預后，巨噬細胞產生的TNF-α下降。表明在LPS刺激RAW264.7細胞后，及早應用PEI能夠有效抑制促炎介質的產生。富含陰離子的LPS能與富含陽離子的PEI結合，但我們的實驗顯示，在LPS孵育RAW264.7細胞10 min后加入PEI，與RAW264.7細胞結合的LPS數量并沒有減少，也就是說PEI并不是通過抑制RAW264.7細胞與LPS的結合來抑制炎癥反應的程度。

綜上所述，PEI能夠在LPS刺激引起的炎癥反應早期抑制炎癥反應的程度，為臨床早期抗炎方案提供了新的思路，其具體作用機制及其在臨床上的可行性仍需要進一步探討。

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