靶向抑制Livin表達對子宮內膜癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響

王曉華，張玉娟

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067000)

子宮內膜癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率及病死率呈上升趨勢[1]。子宮內膜癌患者早期多表現為陰道異常出血，手術治療預后較好[2]。但晚期或復發性內膜癌患者的預后仍較差，中位生存期不超過1年[3]。目前，針對腫瘤基因通路的分子靶向治療是研究的熱點[4]。Livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，在人類胎盤組織以及大多數實體腫瘤細胞中特異性高表達，并與腫瘤的發生、發展關系密切[5]。研究[6]發現，Livin在子宮內膜癌組織中同樣異常高表達，并且與組織學分級和肌層浸潤有關。但是，關于Livin對子宮內膜癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響鮮有報道。2015年12月～2017年2月，我們通過靶向抑制Livin在子宮內膜癌細胞中的表達，觀察Livin對細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，旨在為子宮內膜癌的分子靶向治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料

人子宮內膜癌Ishikawa細胞購自南京凱基生物有限公司；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養基、PBS、胰酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；TRIzol購自美國Ambion公司；Takara RNA PCRTM逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen公司；細胞毒性-增殖檢測試劑盒(CCK-8試劑盒)購自中國北京莊盟生物公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；特異性小分子干擾RNA(Livin-siRNA)及陰性對照序列(Livin-NC)由廣州銳博公司設計合成。

1.2　細胞培養與分組處理

將Ishikawa細胞置于含10% FBS的RPMI1640培養基中常規培養。轉染前24 h將細胞均勻接種于6孔板，調整細胞密度為4×105/mL。按Lipofectamine 2000說明書配制轉染試劑。將細胞分為Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組，Livin-Si組轉染Livin-siRNA干擾序列，Livin-NC組轉染Livin-NC陰性對照序列，空白對照組加入10% FBS。轉染6 h后棄去原培養基，更換為含10% FBS的完全培養基繼續培養。

1.3　細胞中Livin mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR法。轉染后48 h取各組細胞，加入TRIzol試劑提取RNA。逆轉錄合成cDNA。使用SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG熒光定量試劑盒進行目的基因Livin和內參基因GAPDH的RT-PCR擴增反應，目的基因Livin和內參基因GAPDH的引物均由大連寶生物公司設計合成。Livin上游引物5′-ACGGAGCATGCCAAGTGGT-3′，下游引物5′-CTGCACACTGTGGACAAAGTCTCT-3′，擴增產物78 bp；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增產物138 bp。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環，95 ℃ 1 min、60 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s進行熔解曲線分析。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.4　細胞增殖能力觀察

采用CCK-8法。取對數生長期細胞，調整細胞密度至4×104/mL，接種于96孔板。培養24 h后進行細胞轉染，每組設5個復孔，同時設置調零孔，只加培養基不加細胞。于轉染24、48、72、96 h分別加入CCK-8稀釋液20 μL(CCK∶無血清培養基=1∶1)，混勻，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm處吸光度OD值。

1.5　細胞侵襲能力觀察

采用Transwell小室實驗。應用Corning的小室模型，將Matrigel基質膠與無血清培養基按1∶5比例混勻，每個小室100 μL均勻包被小室基底膜。Matrigel基質膠凝固后，上室加入無血清培養基水化基底膜30 min。收集轉染48 h的Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組細胞，PBS洗2次后，0.25%胰酶消化，用無血清培養基重懸，調整細胞密度至4×105/mL。每孔上室加入100 μL單細胞懸液，下室加入600 μL含20% FBS培養基，將小室放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養43 h。擦凈Matrigel基質膠和上室的細胞，4 ℃預冷的甲醇固定30 min。用0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗3遍；取下微孔濾膜，放到載玻片上，用二甲苯稀釋過的樹膠封片。顯微鏡下隨機觀察5個視野細胞數量計數，取平均值，實驗重復5次。

1.6　細胞遷移能力觀察

采用Transwell小室實驗。不用鋪Matrigel基質膠，CO2培養箱中培養時間為30 h，其余同Transwell小室侵襲實驗。

1.7　統計學方法

2　結果

2.1　三組Livin mRNA表達比較

Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組Livin mRNA相對表達量分別為0.462±0.086、0.925±0.023、1.000±0.000。Livin-Si組Livin mRNA相對表達量較Livin-NC組和空白對照組降低(P均<0.01)。

2.2　三組細胞增殖能力比較

轉染后24 h各組細胞OD值比較無統計學差異(P均>0.05)。轉染后48、72、96 h，Livin-Si組細胞OD值低于Livin-NC組和空白對照組(P均<0.01)。見表1。

表1　三組細胞增殖能力比較

注：與Livin-Si組同時點比較，*P<0.01。

2.3　三組細胞侵襲能力比較

Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組穿膜細胞數分別為(22.4±3.6)、(52.6±4.2)和(54.8±2.8)個，Livin-Si組穿膜細胞數較Livin-NC組、空白對照組減少(P均<0.01)。

終于那個人不走，她的手擺在金枝眼下。女人們也越集越多，把金枝圍起來。她好像在耍把戲一般招來這許多觀眾，其中有一個三十多歲的胖子，頭發完全脫掉，粉紅色閃光的頭皮，獨超出人前，她的脖子裝好顫絲一般，使閃光的頭顱輕便而隨意地在轉，在顫，她就向金枝說：

2.4　三組細胞遷移能力比較

Livin-Si組、Livin-NC組和空白對照組穿膜細胞數分別為(34.8±3.8)、(60.8±5.2)和(62.4±4.4)個，Livin-Si組穿膜細胞數較Livin-NC組、空白對照組減少(P均<0.01)。

3　討論

細胞增殖與凋亡失衡是惡性腫瘤形成的重要機制之一。Livin位于20號染色體q13.3，全長4.6 kB，包含7個外顯子和6個內含子。Livin的高級結構由4個α螺旋和一個反平行β折疊的氨基酸重復序列組成，此氨基酸重復序列稱為高度保守桿狀病毒IAP氨基酸重復序列，C端含有RING環指結構域。Lopes等[7]研究證實，Livin在正常成人的大多數組織中不表達或較少表達，在人的胎盤組織、胚胎組織以及大多數實體腫瘤中特異性高表達。Ye等[8]研究發現，Livin在前列腺癌組織中高表達，并通過調節細胞G1/S期促進細胞增殖，推測Livin可能在前列腺癌的發生及細胞增殖方面起重要作用。莊莉等[9]研究表明，抑制Livin基因可明顯抑制肺腺癌SPC-A1細胞的增殖能力并增加細胞對順鉑化療的敏感性。Vucic等[10]研究表明，Livin可明顯促進Jurkat T淋巴細胞增殖，抑制其凋亡，其抗凋亡作用明顯強于B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)。Crnkovic-Mertens等[11]在宮頸癌Hela細胞中利用小分子RNA特異性干擾Livin的表達，Hela細胞的生長明顯受到抑制。Temkin等[12]研究發現，Livin在良性子宮內膜組織中少量表達，在子宮內膜癌組織中特異性高表達，并與組織學分級有關，與臨床分期和淋巴結轉移無明顯相關性。本研究首先將Livin的小分子干擾RNA轉染人子宮內膜癌Ishikawa細胞，實時熒光定量PCR檢測轉染后Livin mRNA表達量降低，說明成功抑制Livin在Ishikawa細胞中的表達。CCK-8實驗結果顯示，干擾Livin表達后，Livin-Si組細胞缺乏指數生長特征，增殖能力明顯受到抑制。

Chung等[13]應用RNA干擾技術，通過免疫組織化學、RT-PCR、Western blotting技術檢測胃癌AGS和SNU638細胞中Livin的表達，發現干擾Livin后能顯著抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。Myung等[14]研究Livin對大腸癌SW480和DK01兩種細胞生物學行為的影響時發現，應用RNA干擾技術抑制Livin基因的表達，可顯著抑制兩種大腸癌細胞的浸潤和轉移能力，而過表達Livin則可促進細胞的侵襲和轉移能力。Wang等[15]應用小分子RNA干擾技術觀察肝癌HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲能力，結果顯示敲除Livin后肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力均明顯受到抑制。本研究侵襲及遷移實驗結果顯示，干擾Livin表達后，與Livin-NC組、空白對照組比較，Livin-Si組穿膜細胞數減少，說明Livin在子宮內膜癌的侵襲轉移中發揮了重要作用，干擾Livin表達可抑制子宮內膜癌細胞的侵襲及轉移能力。

綜上所述，抑制Livin在子宮內膜癌Ishikawa細胞中的表達，可明顯抑制細胞的增殖能力，減弱細胞的侵襲及遷移能力。Livin基因作為IAP家族中的一員，在子宮內膜癌的發生和侵襲轉移過程中發揮了重要作用，相信隨著研究的不斷深入，一定能為子宮內膜癌的靶向治療開拓新的方向。

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