Shh信號通路在大腦皮質發育畸形發生發展中的作用機制研究進展

劉美，鄧萍萍 ，馬勛泰

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000)

皮質發育是一個非常復雜的過程，主要包括神經干細胞的自我更新、分化、遷移、成熟等步驟，其中涉及許多信號通路的激活。由于發育信號級聯過程中的異常則可導致嚴重的先天性異常，如皮質發育畸形(MCD)。MCD是由于皮質發育過程中某些基因或蛋白發生突變或異常而引起的，是難治性癲癇的主要病因。MCD是一組疾病，包括局灶性皮質發育障礙、前腦無裂畸形(HPE)、室周異位癥(PH)、小頭畸形(MCPH)、巨腦回畸形、無腦回畸形等。目前人們已發現mTOR信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路、Wnt信號通路、Reelin信號通路，以及最近備受關注的Sonic hedgehog (Shh)信號通路[1]等多條信號通路與大腦MCD有關。mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素[2]等已應用于動物實驗及臨床，證明其能改善MCD的病理及臨床表現。Shh信號通路與皮質發育障礙密切相關。Shh基因編碼的Shh蛋白是多種組織器官發育所必需的，包括中樞神經系統、泌尿生殖系統、呼吸系統、消化系統、四肢和眼睛等[3]。在中樞神經系統中，Shh信號通路與HPE、PH、MCPH、Feingold 綜合征、Jouber綜合征(JS)密切相關?，F將Shh信號通路在大腦MCD發生發展中的作用機制相關研究進展綜述如下。

1 Shh信號通路

果蠅刺猬(hh)基因是1980年在對果蠅發育研究過程中發現的一種基因，哺乳動物體內有3種hh同系物：Shh、Desert Hedgehog(DHH)、Indian Hedgehog(IHH)[4]，分別編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白。 Shh與腦、脊髄、肺臟、腎臟、毛發、面部和四肢等多種器官的形態形成有關，與腫瘤的發生有關[5]。

Shh信號傳導通路由Shh、Patched(Ptc)、Smoothened(Smo)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(Fu)、Fu抑制劑(SuFu)、類運動蛋白 (Cos2)、蛋白激酶A(PKA)及下游的鋅指轉錄因子Gli蛋白組成。Ptc由抑癌基因編碼，是由12個跨膜區的單一肽鏈構成，是Shh的受體，在沒有配體結合的情況下，抑制Smo的活性，對Shh信號起負調控。 Smo由原癌基因編碼，是一個7次跨膜的G蛋白偶聯受體，N端位于細胞外，C端位于細胞內，跨膜區氨基酸序列高度保守，C 末端的絲氨酸與蘇氨酸殘基為磷酸化部位，蛋白激酶催化時結合磷酸基團，其磷酸化水平改變核轉錄因子的活性狀態[6]。Smo是Hh信號傳遞所必須的受體。在無Hh、Ptc的情況下，激活Smo可導 致Hh 靶基因的活化；基因Smo突變時，可出現與Hh 基因突變相同的表征。其中Ci/Gli、Fu起正調控作用，Cos 2、PKA起負調控作用。Gli蛋白家族成員是較大的多功能的轉錄因子，屬于C2 H2型鋅指結構蛋白。Gli蛋白是一種多功能轉錄因子，脊椎動物中Gli至少由Gli1、Gli2、Gli3 3種成分組成，Gli1、Gli2主要起轉錄激活作用，Gli3起轉錄抑制作用[7]。

Shh信號通路主要包括胞膜部分、胞質和胞核三部分，當不存在hedgehog配體時，胞膜上的Shh受體Ptc將抑制Smo的活性，Smo無法將Shh信號向胞內傳導，胞漿內Gli與一些蛋白如Fu、cos2、Sufu在微管上結合形成復合物，Gli被蛋白酶水解為非活性形式導致其下游的轉錄受到抑制。當hedgehog與Ptc結合時，Smo上的抑制效應被解除，處于激活狀態的Smo聚集在初級纖毛上并引起Cos2和Fu過度磷酸化，導致復合物從微管上解離，Gli的蛋白水解被抑制，其以活性形式進入細胞核，進入細胞核以后Ciact與CREB結合蛋白(CBP)結合并激活Shh靶基因，以維持胚胎發育、促進自我更新、血管生成等多種生物學活性[5]。

Shh基因及其信號通路在胚胎的發生、發育中起重要作用，涉及許多器官的發育及成體組織穩態的各個方面。在神經系統的作用主要包括兩個方面，一是對神經系統發育的誘導作用，二是對神經系統腫瘤形成的影響。它介導細胞增殖、分化和凋亡等重要發育過程。

2 MCD的發病機制

MCD的解剖和組織學亞型取決于影響大腦正常發育失敗的時刻及損傷的嚴重程度或遺傳異常。其發病機制主要包括：①遺傳因素，如染色體異常、基因突變等；②物理化學損傷，包括電離輻射、酒精、飲食等；③感染，包括病毒或細菌的感染，如巨細胞病毒、寨卡病毒等；④其他。MCD是一組有著高度臨床表現異質性和致殘性的疾病，是神經系統發育遲緩和癲癇的常見原因，尤其是難治性癲癇，據估計，高達40%的難治性癲癇患兒有MCD[8]。多數MCD可通過中等-高分辨MRI檢查進行區分。MRI上的關鍵特征包括MCD的分布部位及嚴重程度、皮質表面情況、灰白質之間的界限、皮質厚度及相關腦部畸形等。

根據皮質發育的過程可將MCD形分為三大類：Ⅰ組神經元和神經膠質增殖或凋亡有關的畸形，包括MCPH，巨腦癥等；Ⅱ組神經元異常遷移有關的畸形，如無腦回畸形、鵝卵石樣畸形等；Ⅲ組皮質組建異常有關的畸形，如多小腦回畸形、局灶性皮質發育障礙(FCD)等[9]。其中國際抗癲癇聯盟(ILAE)在2011年報告了一個三級分類系統，將局灶性皮質發育障礙分為FCDI型：神經元遷徙及成熟異常導致的皮層分層異常的皮質畸形。FCDII型表現為皮層分層異常和異性神經元的皮質畸形。FCD Ⅲ型表現為皮層異常伴其他臨近組織病變[10]。

3 Shh在MCD發生發展中的作用機制

3.1 Shh在HPE發生發展中的作用機制 HPE又稱全前腦畸形，是胚胎發育過程中，前腦發育障礙引起的一組復雜的顱腦和面部畸形。HPE是一種遺傳異質性疾病，其臨床表現為極為嚴重的中樞神經系統及顏面畸形，常造成流產、死產或胎兒1 歲內死亡，新生兒存活率極低。HPE也可表現為臨床癥狀較輕的腦畸形，導致患兒出現小頭癥、智力低下、癲癇等。HPE的病因尚不清楚，多數學者認為與環境和遺傳因素有關。與 HPE 相關的遺傳致病因素主要有單基因突變、基因組拷貝數目變異 (CNVs) 及染色體異常[11]。

Shh是最著名的導致HPE的基因，對誘導腹側神經管的發育具有重要的作用。在Shh(-/-)小鼠模型中小鼠前腦、中腹側結構不存在，大腦端腦結構無法分開，眼球不分離，形成一系列腦、脊索和顱面異常[12]，模擬了人類HPE的表型。Erich等[13,14]，證實了Shh的單倍體不足在人類中可引起HPE。另外有研究[15]使用Shh信號通路拮抗劑環巴胺及其有效類似物作用于孕鼠，其子代產生了唇裂、腭裂及HPE相關表型，環巴胺主要抑制Smo從而抑制了Shh信號傳導。乙醇、視黃酸等HPE致畸劑由于消除了Shh信號傳導從而產生前腦裂畸形一系列表型[16]。在HPE患者中也發現存在跨膜蛋白受體PTCH1基因突變[17]。Shh信號通路的下游效應因子Gli2的變異同樣可以導致HPE，Gli2-/-可以導致腦部、面部畸形，而Gli2+/-可使實驗動物對致畸因子引起的HPE的敏感性增加[18]。端腦和間腦的分離還取決于Shh與Gli3的相互作用[19]。Shh通過自切割產生N-端和C-端兩個片段，Shh-N的末端共價結合一個膽固醇分子，有研究[20]在動物模型中給予膽固醇合成的抑制劑，同樣導致了HPE樣畸形。

3.2 Shh在PH發生發展中的作用機制 PH是最常見的MCD之一，主要臨床表現為癲癇發作、智力低下和不同程度的精神運動發育遲緩，影像學主要表現為雙側側腦室旁對稱的連續或者不連續的結節狀的異位灰質。83%～100%經典的家族性PH女性患者與細絲蛋白A(FLNA)基因突變有關。除FLNA基因之外，二磷酸腺苷基化因子鳥嘌呤核苷酸交換因子2 (ARFGEF2)基因以及多聚谷氨酰胺結合蛋白1(PQBP1)基因突變同樣可以引起PH相同的表型。FLNA編碼一種大型微絲結合磷酸化蛋白，可穩定細胞骨架，有利于腦室上皮局部黏附的正確形成。ARFGEF2基因編碼BIG2，BIG2是蛋白激酶A錨定蛋白(AKAP)，其通過其Sec7結構域調節囊泡轉運和從細胞內向細胞表面轉運的過程[21]。Big2和FLNA相互作用調節整合素/樁蛋白在細胞膜的穩定性和周轉，從而直接影響神經遷移。神經遷徙的機制之一為頂端脫離。損失FLNA或BIG2導致沿神經外膜各種細胞黏附相關蛋白如鈣黏蛋白和樁蛋白的減弱表達[22，23]，可使頂端提前脫離，在脫離之前，Shh信號通過初級纖毛維持[24]。這個纖毛在轉導Shh信號維持神經上皮細胞在增殖狀態中發揮關鍵作用[25]，頂端脫離導致纖毛的解體，纖毛解體使 Shh信號傳導喪失和與祖細胞離開細胞周期的增殖下降，從而參與異位結節的產生。低密度脂蛋白相關蛋白2(LRP2)編碼巨蛋白。巨蛋白已被證明在前腦中螯合Shh，并介導Shh-Ptch內吞作用[26]。LRP2突變可影響Shh信號通路的傳導，可解釋LRP2突變患者中觀察到的異常神經元定位。

3.3 Shh在MCPH發生發展中的作用機制 MCPH又稱原發性小頭癥，是一組腦發育的常染色體隱性遺傳性疾病。小腦癥基因(MCPH1)、WD重復區域-62(WDR62)、細胞周期依賴蛋白激酶調節相關蛋白2基因(CDK5RAP2)、人類中心體蛋白152基因(CEP152)、非正常紡錘體樣蛋白基因(SPM)、著絲粒相關蛋白基因CENPJ和SCL-TAL1干擾位點(STIL)等11個基因與MCPH的發生發展有關，并且其中大多數基因編碼與有絲分裂紡錘體相關的中心體或中心體蛋白質[27]。MCPH臨床主要表現為小頭畸形和非進行性神經發育遲滯。在由ASPM基因突變導致的小頭畸形患者中有較高頻率的癲癇發作，但其他類型罕見[28]。研究[29，30]表明最近發現的MCPH基因SIL / STIL與Shh信號通路密切相關，已經通過免疫熒光顯微鏡確定STIL - / -小鼠胚胎缺乏中心粒和原發性纖毛，而Shh信號通路的激活和傳導依賴于原發性纖毛的形成。STIL在細胞質中與SuFu相互作用以調節Shh信號，參與MCPH的形成[31]。

3.4 Shh在Feingold 綜合征、JS發生發展中的作用機制 Feingold綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病。它的特點是小頭癥、食管和十二指腸閉鎖，常伴有學習障礙或智力遲鈍，少數患者中還伴有肛門閉鎖、椎體異常、心臟畸形和耳聾、腎囊性發育不良。Feingold綜合征可分為1型和2型，均可表現為小頭癥、學習障礙或智力遲鈍等。1型主要由癌基因MYCN突變引起，定位在2p24，2型在染色體13q31.3上發現有MIR17HG基因的半合子缺失。

研究[32]發現小鼠體內Shh突變及其下游效應因子Gli2和Gli3的改變可以導致氣管、食道、腎、椎骨和心臟的異常，其中小頭畸形反映背側端腦的生長和發育減少。Shh-/- 小鼠可以具有前腦部分缺失的表征，這表明胚胎期腹側端腦發育的紊亂，小鼠Gli3-/-也有異常發育的端腦。因此，Shh突變及其下游效應器的突變可導致在人和小鼠中與Feingold綜合征各種畸形一致的表型。

JS是具有常染色體隱性遺傳或X連鎖遺傳的先天性小腦共濟失調，其診斷標志是頭顱MRI中獨特的小腦和腦干畸形“臼齒標志”。迄今為止，已經鑒定了21個致病基因，所有致病基因均可編碼初級纖毛及其相關蛋白質，在脊椎動物中Shh信號通路許多核心成分，如Patched1(Ptch1)、Smoothened(Smo)、Sufu和Gli轉錄因子，均要定位于纖毛上，纖毛功能障礙可導致Shh通路嚴重破壞[5]。幾個JS相關基因中的突變已經與Shh信號異常傳導相關聯，并且這些基因敲除的小鼠顯示了一系列與Shh缺失相關的表型，包括一系列腦發育異常如神經管背部和閉合缺陷、腦畸形、后肢畸形等[33]。有研究[34]對人類JS胎兒樣本進行分析發現，在不同基因突變引起的JS、MKS或Jeune綜合征患者妊娠16周后，胎兒小腦顆粒祖細胞的增殖顯著減少，同時與正常組相比Gli1 mRNA和Ptc蛋白水平降低或不可檢測，表明Shh信號通路的異常與JS綜合征小腦發育不良有關。

綜上所述，MCD的發生、發展涉及許多信號通路的激活。Shh信號通路的異常在MCD的發生、發展中起重要作用，Shh途徑的各種成分缺失將導致胚胎死亡或具有明顯的畸形，基因敲除動物模型在研究Shh信號通路功能方面具有極大幫助。但目前關于Shh信號通路與MCD的關系仍未完全闡明，如Shh信號通路對不同類型皮質發育畸形的影響，其具體作用蛋白及調控機制，是否涉及其他信號通路的激活，同時Shh信號通路本身仍存在疑惑，如上游hh信號的產生及調節機制，Ptc究竟是通過何種機制對Smo進行調控，通路中磷酸化事件的具體作用等。