石首地區野生麋鹿自然保護區重要病原菌(蟲)調查

王明月周東海* 郭定宗溫華軍李鵬飛郭 銳常 優方 瑞

(1.華中農業大學，武漢，430070；2.石首麋鹿國家級自然保護區管理處，石首，434407；3.湖北省農業科學院，武漢，430064)

麋鹿(Elaphurusdavidianus)原為中國獨有的物種，距今已有300萬年的歷史。歷史上的麋鹿有5個種，現只有達氏種生存至今，其他物種均已滅絕[1-2]。1900年八國聯軍攻入北京，南海子麋鹿被西方列強掠奪一空，麋鹿在中國國土上基本滅絕。新中國成立后，中國政府希望能使麋鹿重回中國故鄉，但由于繁殖障礙，最初被引進的2只麋鹿一直未能順利繁殖。1985年北京麋鹿生態實驗中心從英國烏邦寺引進麋鹿38頭，使得麋鹿重回故鄉[3]。現階段麋鹿為中國國家Ⅰ級保護野生動物。發展至今，中國已擁有江蘇大豐野生麋鹿群、湖北石首野生麋鹿群和洞庭湖野生麋鹿群3大野生麋鹿種群[1]。

經過多年的努力，野生麋鹿種群得到了快速的增長。但由于野生麋鹿生存環境的特殊性和麋鹿本身的生物學特性，使得在野生麋鹿疾病的治療和管理上困難重重。2010～2011年，石首麋鹿自然保護區野生麋鹿大量死亡。由于當時麋鹿數量多達700余頭，超過保護區存載量，環境自然降解能力降低，劇烈的天氣變化等客觀因素和保護區缺乏防疫基礎設施、定期的疫病監測和有效的監測手段等主觀因素共同影響，使得麋鹿大規模暴發疫病[4]。麋鹿作為珍稀動物，對它保護所帶來環境生態效益是難以估量的，其對生物多樣性保護意義遠遠超過單一物種的生存和繁衍問題。對麋鹿及其自然棲息地的保護促進了整個生態系統的保護，推動了中國野生動物保護事業的發展。麋鹿作為重要的可再生保護資源，是極具經濟價值的動物。本文通過調查石首麋鹿自然保護區內重要病原菌和寄生蟲的感染情況，對于建立完善的疫病防控體系，保護區進行合理科學的管理規劃具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

2016年8月采集的麋鹿糞便11份。

2016年8月采集的病死麋鹿臟器：包含肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、腸管等。

2016年12月采集的麋鹿糞便12份。

(本試驗所使用的病料均由湖北石首野生麋鹿自然保護區工作人員提供)。

1.1.2 試驗藥品及儀器

光學顯微鏡；顯微攝影成像系統；PCR儀；電腦三恒多用電泳儀；超凈工作臺；電熱恒溫培養箱；高級凝膠成像系統。

TSA培養基；SS培養基；EMS培養基；MAC培養基；厭氣肉肝湯；營養肉湯；Mueller-Hinton瓊脂；脫脂綿羊血(以上試劑均購自青島海博生物技術有限公司)；16S rRNA上下游引物；PCR Mix(以上試劑均購自武漢擎科生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離純化及形態學觀察

無菌條件下，將糞便樣品接種于TSA培養基上，37℃培養18 h，挑取不同菌落分別接種于TSA培養基、SS培養基、MAC培養基和EMS培養基上并編號，37℃培養18 h。無菌條件下，切開臟器，用接種環刮取臟器內表面滲出液，分別接種于鮮血平板和TSA培養基上，37℃培養18 h，觀察菌落的生長情況及細菌的溶血情況。挑取不同菌落分別接種于TSA培養基、SS培養基、MAC培養基和EMS培養基上并編號，37℃培養18 h。

觀察菌落形態和特點，挑取不同的單菌落，革蘭氏染色鏡檢，觀察顯微鏡下細菌形態。記錄形態，采集圖像。挑取單菌落，接于NB肉湯中，搖床中富集18 h。

1.2.2 分離菌株的16S rRNA PCR鑒定

PCR檢測：于PCR管中加入無菌蒸餾水9 μL，Mix 12 μL，16S-f1 μL，16S-r1 μL，培養18 h的菌液2 μL，制成25 μL反應系統，混勻，振蕩，離心。

PCR擴增條：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火60 s、72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。取4 μL的PCR反應產物，用1%的瓊脂糖凝膠(每100 mL 1%的TAE加入5 μL的EB)電泳，電壓160 V，置于凝集成像系統下拍照。

PCR測序：將電泳跑出明顯條帶的菌液送至武漢擎科創新生物有限公司進行測序。

1.2.3 寄生蟲檢查方法

1.2.3.1 飽和食鹽水浮聚法

取少量糞便和適量飽和食鹽水于研缽中研磨后，置于5 mL一次性玻璃瓶中，慢慢往瓶中加入飽和食鹽水，直至液面為凸液面而不溢出，在瓶口覆蓋一載玻片，靜止15 min后，將載玻片提起并迅速翻轉，蓋上蓋玻片，鏡檢。

1.2.3.2 沉淀集卵法

取10 g糞便于研缽中，加入少量清水充分研磨，經80目金屬分樣篩過濾至50 mL燒杯中，加入清水至杯口，靜止15 min，倒去上清，重新加滿水，靜置15 min，如此重復3次，最后倒去上清液，用滴管吸取底層沉渣滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡檢。

2 實驗結果

2.1 細菌分離結果

2.1.1 細菌形態

從采集的糞便樣品和病死麋鹿臟器中共分到8類菌，其在營養瓊脂的生長情況和革蘭氏染色結果如下。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)在TSA培養基上生成圓形菌落，邊緣光滑，灰白色菌落；顯微鏡下觀察到的結果，革蘭陰性菌，菌體呈短桿狀(圖1，左圖)。志賀桿菌(Shigabacillus)在TSA培養基上為透明、圓形的小菌，在MAC上為無色菌落，顯微鏡下觀察到的結果，革蘭陰性菌，直桿菌(圖1，右圖)。

圖1 嗜水氣單胞菌(左圖)；志賀桿菌(右圖)Fig.1 Aeromonas hydrophila(left)；Shigella(right)

圖2 蠟樣芽孢桿菌(左圖)；大腸桿菌(右圖)Fig.2 Bacillus cereus(left)；Escherichia coli(right)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)在TSA培養基上形成近似圓形的白色有光澤菌落，在血瓊脂培養基上為邊緣不整齊的毛玻璃狀灰白色菌落；顯微鏡下觀察到的結果，革蘭氏陽性桿菌，菌體細胞桿狀，末端方(圖2，左圖)。大腸桿菌(Escherichiacoli)在TSA上為光滑濕潤半透明菌落，EMS上生成黑色有金屬光澤的菌落，MAC上為粉紅色菌落；顯微鏡下觀察到的結果，革蘭氏陰性短桿菌(圖2，右圖)。

圖3 鏈球菌(左圖)；糞腸球菌(右圖)Fig.3 Streptococcus(left)；Enterococcus faecalis(right)

鏈球菌(Streptococcus)在TSA上不生長，在鮮血培養基上形成透明溶血現象，生長良好；顯微鏡下觀察到的結果，革蘭氏染色陽性，球形或卵圓形，呈鏈狀排列(圖3，左圖)。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)在TSA培養基上生成半透明、濕潤的小菌落；顯微鏡下觀察到的結果，革蘭氏染色陽性，卵圓形菌(圖3，右圖)。

圖4 產氣莢膜梭菌(左圖)；乳酸桿菌(右圖)Fig.4 Clostridium perfringens(left)；Lactobacillus(right)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)在厭氣肉肝湯液體培養基中，產生氣體；顯微鏡下觀察到的結果，革蘭氏染色陽性，大腸桿菌，兩頭鈍圓，菌體卵圓形(圖4，左圖)。乳酸桿菌(Lactobacillus)在TSA培養基上形成白色不透明小菌落，邊緣不光滑，生長良好；顯微鏡下觀察到的結果，革蘭氏顏色陽性，菌體桿狀，單個或呈短鏈存在(圖4，右圖)。

2.1.2 PCR測序結果

如圖5所示，4、6、7、11泳道為大腸桿菌電泳結果，5泳道為嗜水氣單胞菌電泳結果，10泳道為糞腸球菌電泳結果，12泳道為蠟樣芽孢桿菌電泳結果，15泳道為志賀桿菌電泳結果。

將PCR產物送檢測序，結果與NCBI參考菌種16S rRNA基因核酸序列進行同源性分析比較，得出乳酸桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌、嗜水氣單胞菌、糞腸球菌、志賀桿菌和鏈球菌的

核苷酸序列同源性均在97%～100%之間。結合菌株鏡檢形態和生長特性，從而確定分離得到純培養菌株的種屬。

圖5 PCR產物電泳結果Fig.5 Electrophoretic results of PCR products

2.2 寄生蟲鑒定結果

在2016年8月收集的11份樣品中，共檢測到3種蟲卵。

血矛線蟲(Haemonchuscontortus)卵，呈橢圓形，平均大小70 μm×50 μm，卵殼光滑且薄，卵內含8～10個胚細胞(圖6，A圖)，檢出率為1/11。前后盤吸蟲(Paramphistomum)卵，呈橢圓形，平均大小125 μm×90 μm，淺灰色，卵黃未充滿整個蟲卵(圖6，B圖)，檢出率為2/11。貝氏莫尼茨絳蟲(Monieziabenedeni)卵，呈不規則四角形，平均大小40 μm×55 μm卵內有特殊的梨形器，器內含六鉤蚴(圖6，C圖)，檢出率為1/11。

在2016年12月收集的11份樣品中，未檢測到蟲卵。

圖6 A圖，血矛線蟲卵(卵圓形，小于100 μm)；B圖，前后盤吸蟲卵(卵圓形，大于100 μm)；C圖，貝氏莫尼茨絳蟲卵(不規則四角形，小于100 μm)Fig.6 A，Haemonchus contortus egg(oval，less than 100 μm)；B，Paramphistomum egg(oval，more than 100 μm)；C，Moniezia benedeni egg(irregular quadrangle，less than 100 μm)

3 討論

3.1 病原菌結果討論

本研究通過對2016年8月和2016年12月的兩批樣本進行病原菌分離鑒定，得到大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、志賀桿菌、蠟樣芽孢桿菌、鏈球菌、糞腸球菌、產氣莢膜梭菌和乳酸桿菌8種細菌，其中糞腸球菌、乳酸桿菌和大腸桿菌為正常存在于腸道的菌種，且乳酸桿菌為益生菌，而大腸桿菌為機會致病菌。嗜水氣單胞菌廣泛存在于水源和水生動物體內，是一種條件致病菌，在條件合適的情況下會產生外毒素，如溶血素、腸毒素等，對麋鹿的健康存在一定的威脅[5]。

在病死麋鹿病料中分離得到的志賀桿菌、蠟樣芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌和鏈球菌均能導致麋鹿生病甚至死亡。蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于麋鹿生活地區的水域和土壤中，同樣可存在于麋鹿食用的食物中和麋鹿的腸道內，其產生的腸毒素，可引起麋鹿的中毒性腹瀉。產氣莢膜梭菌是一類革蘭氏陽性菌，可存在于麋鹿可飼食物中和水體中，主要導致動物腸毒血癥，張林源等[6]研究中曾報道該菌引起麋鹿大量死亡的事實。鏈球菌主要通過飛沫傳播，在麋鹿病料中分離到的鏈球菌為溶血性鏈球菌，此類鏈球菌致病力強，引起動物的肺炎、腎炎、敗血癥等疾病，對麋鹿的健康存在嚴重的威脅。志賀桿菌又稱痢疾桿菌，通過食物和水源傳播，夏秋季感染性較高，可引起動物機體腹瀉。

3.2 寄生蟲結果討論

2016年8月麋鹿糞便寄生蟲卵檢測陽性率為23.3%(3/11)，而2016年12月麋鹿糞便樣本均未檢出寄生蟲卵。兩批樣本結果的差異，可能是由于季節因素導致的。湖北石首麋鹿自然保護區位于N29°25′，E112°14′，屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為15.9℃～16.6℃[7]。8月正值夏季，降雨量大，平均氣溫高，環境條件適合寄生蟲傳播和繁殖。而12月正值冬季，氣溫相對較低，寄生蟲存活率低，所以麋鹿感染寄生蟲的概率有很大程度的降低。

此次調查檢測出的腸道寄生蟲蟲卵主要為前后盤吸蟲卵、貝氏莫尼茨絳蟲卵和血矛線蟲卵。由于麋鹿擅長游泳，且石首位于濕地生態系統，區內分布多種淡水螺，為吸蟲的傳播提供了大量中間宿主，所以石首地區的麋鹿吸蟲的檢出率相對于其他地區較高[8]。貝氏莫尼茨絳蟲在綿羊體內的檢出率較高[9]，而關于鹿科動物，該蟲寄生的相關報道較少。血矛線蟲寄生于反芻動物皺胃，在野生反芻動物中檢出的報道較多，在鹿科動物寄生蟲調查中也曾報道[10]。

3.3 疫病防控體系建立討論

根據此次調查結果，現提出以下疫病防控建議：

建議保護區內工作人員對麋鹿活動地區水體、土壤進行定期消毒，適當選擇消毒液種類；注重疫病防控，安排人員定期統計保護區內麋鹿發病率和死亡率；于保護區工作站配備專業的獸醫，能在疫病發生第一時間做出準確診斷，并能提出針對性的治療方案；針對麋鹿地區存在的重要致病菌和寄生蟲，配備相應敏感抗生素和驅蟲藥物，對發病動物進行人工干預治療；對死亡麋鹿，合理地進行無害化處理。

[1] 丁玉華，任義軍，溫華軍，等.中國野生麋鹿種群的恢復與保護研究[J].野生動物學報，2014，35(2)：228-233.

[2] 丁玉華.中國麋鹿研究[M].吉林：吉林科學技術出版社，2004.

[3] 新華網.麋鹿回歸20年：命運多舛話麋鹿[EB/OL].(2005-08-25).http：//news.sina.com.cn/s/2005-08-25/18386782089s.shtml.

[4] 鐘震宇，李鵬飛.湖北石首麋鹿保護區麋鹿疫病防控體系建設探討[J].養殖與飼料，2016(10)：19-22.

[5] 于學輝，王遠微，湯承，等.嗜水氣單胞菌的研究進展[J].西南民族大學學報：自然科學版，2007，33(3)：507-514.

[6] 張林源，溫華軍，鐘震宇，等.湖北石首野生麋鹿種群大量死亡原因調查[J].畜牧與獸醫，2011，43(4)：89-91.

[7] 單云芳，鐘震宇，程志斌，等.不同棲息地麋鹿腸道寄生蟲的調查研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2017(3)：240-242.

[8] 郭定宗，鄒苗，溫華軍，等.麋鹿腸道寄生蟲感染流行病學調查[J].畜牧與獸醫，2016，48(2)：112-115.

[9] 楊祎程，王雯慧，祁珊珊，等.貝氏莫尼茨絳蟲感染綿羊對小腸局部黏膜淋巴組織的影響[J].畜牧獸醫學報，2012，43(1)：112-118.

[10] 孫愛國，狄敏，唐德琦，等.長頸鹿血矛線蟲病的診治[J].畜牧與獸醫，2014，46(4)：61-63.