乳源性益生元對三線閉殼龜生長性能和營養成分消化率的影響

魏 凱陳春山* 耿 琰盧 巖

(1.北京市水生野生動植物救護中心，北京，102100；2.北京動物園，北京，100044)

三線閉殼龜(Cuoratrifasciata)，又稱金錢龜，隸屬龜鱉目(Testudines)、龜科(Emydidae)、閉殼龜屬，國內主要分布于海南、廣東、廣西等地，國外主要分布于老撾和越南[1]，國內很多學者對其生物學特性[2-4]、疾病防治[5-6]和養殖模式[7-8]等方面開展了大量研究。但隨著三線閉殼龜藥用保健和觀賞價值被逐漸挖掘，市場需求劇增，對其野生種群的過度利用情況相當嚴重，從而導致其資源量在短時間內顯著下降。目前，三線閉殼龜的野生資源已瀕臨滅絕，在平原及丘陵地區已經絕跡[9-10]。為了更好地保護三線閉殼龜的種群資源，我國于1988年將其列為國家Ⅱ級重點保護野生動物，《中國瀕危動物紅皮書》也將其列入極危等級[11]，對其野生資源的利用進行了嚴格的限制。在此背景下，我國南方地區的部分養殖戶從上世紀90年代開始嘗試人工飼養三線閉殼龜，隨著養殖技術的不斷成熟，養殖個體數量也得到了較大提升，很大程度上緩解了市場對野生資源的消耗。可以說，人工養殖技術的發展是解決三線閉殼龜瀕危狀態的有效途徑之一。但除現有的技術成果之外，仍存在一些問題，例如沒有針對三線閉殼龜的專用飼料，而其他常見的龜鱉飼料在粗蛋白含量和營養物質配比方面也無法滿足其日常需求。因此，如何通過改良飼料配比來實現健康養殖目的依然是我們努力的方向。目前，通過在水產飼料中添加植物提取物[12]、微生態制劑[13]等成分來促進動物生長和提高免疫能力的研究逐漸受到人們的重視，這對龜鱉養殖中的飼料配比合成也具有指導意義。

微生態制劑主要包括益生菌(Probiotics)、益生元(Prebiotics)及合生元(Synbiotics)。其中，益生元一般是指能夠選擇性地促進腸道有益菌群的增殖，對宿主健康及生長起到直接或間接作用的非消化性食物成分。目前常用的益生元主要是寡糖、多糖和酸化劑，常用來提高動物對飼料的消化和營養物質的吸收利用，從而降低飼料原料中主要蛋白飼料的用量。近年來，通過在水產飼料中添加益生元來促進個體生長，提高蛋白酶活性，增強宿主非特異性免疫力的研究逐漸成為熱點，例如對草魚生長和非特異性免疫能力的影響[14]；對大菱鲆幼魚生長性能、體組成的影響[15]；對克氏原螯蝦生長的影響[16]等研究。但目前還缺乏對三線閉殼龜個體生長、免疫能力以及飼料配比的相關研究。本研究采用在三線閉殼龜的飼料中添加一定比例的乳源性益生元(百泰?-A，其有效組分為35%的粗蛋白和53%的寡糖)，以了解其對三線閉殼龜生長性能以及營養成分表觀消化率的影響，為今后篩選最適宜的添加比例提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

本試驗所用飼料由中國農業科學院飼料研究所提供，基礎飼料中粗蛋白含量為44.78%、粗脂肪為7.78%、總能為17.61MJ/kg，基本可以滿足三線閉殼龜的日常營養需求[17-18]。在2個試驗組中，分別添加0%(對照組)和1%(試驗組)的益生元(百泰?-A)，以G0、G1組表示，本實驗所用的益生元(百泰?-A)是由美國國際原料公司提供，由自溶性啤酒酵母、奶組分和曬干的發酵產物組成的天然產品，其有效組分為35%的粗蛋白和53%的寡糖。飼料原料粉碎后經擠壓制成2.0 mm的膨化顆粒飼料，原料混合時每組飼料中添加0.1% Y2O3作為指示劑，用于測定各類營養成分的表觀消化率。2組飼料配方及營養成分見表1，氨基酸組成見表2。

表1 基礎日糧配方和營養水平(%)

Tab.1 Diet formula and nutrition level

表2 2組飼料中的氨基酸組成(%)

Tab.2 Amino acids composition of two groups

1.2 試驗龜及其飼養管理

1.2.1 試驗分組

試驗用龜購自廣東某養殖場，均為3齡雌性個體。將30只體質健康且無疾病的三線閉殼龜，隨機分為2組，經單因子方差分析(One-way ANOVA)2組間的初始體重無顯著差異(P>0.05)。

1.2.2 試驗時間、地點和養殖設施

試驗在北京市水生野生動植物救護中心爬行動物飼養室進行，養殖時長為150 d。飼養設施采用“爬行天下”的PB-120型智能箱，規格為120 cm×50 cm×50 cm，具備UVA、UVB、陶瓷加熱及通風網等設備，并采用控溫器保持水溫恒定(±0.1℃)，試驗期間水溫控制在30℃。每箱養殖實驗龜3只。試驗開始前用20%高錳酸鉀溶液刷洗缸底和缸壁，5%聚維酮碘溶液浸泡1 d后待用。

1.2.3 飼養管理

試驗期間每天10：00定時投喂1次，2 h后清理殘余餌料。殘余餌料烘干后稱重，以準確記錄每組龜的攝食量，每隔30 d稱量實驗龜體重1次。

1.3 糞樣收集

本試驗的糞便樣品收集方法參考沈建偉等[19]，待糞樣收集完畢后置于70℃烘箱烘干，-20°C冰箱備檢。

1.4 分析檢測

飼料中的粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分的測定分別按照國家標準方法GB/T6432-1994、GB/T6433-2006、GB/T6435-2006和GB/T6438-1992進行檢測。總能采用氧彈燃燒法測定。

飼料和糞便中的氨基酸測定按照國家標準GB/T 18246-2000進行檢測。飼料和糞便中三氧化二釔(Y2O3)含量測定依據王赤龍等[20]方法，采用等離子發射光譜ICP-AES法測定。

1.5 數據計算及統計分析

1.5.1 各營養物質表觀消化率

各營養物質表觀消化率(Apparent digestibility coefficients，ADCS)的計算公式如下：

ADCS%=[1-(F/D×DY/FY)]×100

式中：D-飼料中某種營養成分的含量(%)；F-糞便中相應營養成分的含量(%)；DY-飼料中三氧化二釔(Y2O3)的含量(%)；FY-糞便中三氧化二釔(Y2O3)的含量(%)。

1.5.2 生長性能的評價指標及計算方法

試驗龜體重凈增量、日增重量、相對增重率、飼料系數、攝食率計算如下：

體重凈增量(g)=終末體重-初始體重；日增重量(g/d)=體重凈增量/飼養天數；增重率(%)=(體重凈增量/初始體重)×100；飼料系數=攝食量/體重凈增量；攝食率(%)=攝食量/[(初始體重+終末體重)/2×飼養天數]×100；蛋白質效率(%)=(體重凈增量/粗蛋白質攝入量)×100。

1.5.3 數據處理

所有數據采用“平均值±標準差”表示。所有數據經SPSS19.0軟件進行方差齊性檢驗(Homogeneity test for variance)，如果方差齊性，采用單因子方差分析(One-way ANOVA)；如果方差不齊，則進行非參數檢驗(K-W分析)，P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 飼料中添加乳源性益生元后對三線閉殼龜生長性能的影響

研究結果表明，飼料中添加乳源性益生元后G1組的終末體重、相對增重率、日增重量、蛋白質效率均顯著高于G0組(P<0.05)，而飼料系數及攝食率均顯著低于G0組(P<0.05)(表3)。

表3 三線閉殼龜的生長性能(平均值±標準差)

Tab.3 Growth index of Cuora trifasciata

注：同一行數據肩標字母不同，表示存在顯著差異(P<0.05)。下表同

Note：The same line of data is different from the superscript letter，which means there is a significant difference(P<0.05).The following table is the same

2.2 飼料中添加乳源性益生元后對蛋白質和干物質表觀消化率的影響

結果表明，飼料中添加乳源性益生元后對G0組和G1組的蛋白質和干物質消化率分別為，G1組均顯著高于G0組(P<0.05)(表4)。

表4 蛋白質和干物質表觀消化率結果(平均值±標準差)(%)

Tab.4 Apparent digestibility of protein and dry matter

2.3 飼料中添加益生元后對氨基酸消化率的影響

結果表明：G0組和G1組間總氨基酸消化率沒有顯著差異(P>0.05)。必需氨基酸中，G1組的蛋氨酸、組氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸的消化率均顯著高于G0組(P<0.05)；非必需氨基酸中，G1組的胱氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的消化率顯著高于G0組(P<0.05)(表5)，其余的氨基酸消化率沒有顯著差異(P>0.05)。由于分析檢測過程中色氨酸被破壞，故無法檢出比較。

表5 兩組飼料的氨基酸表觀消化率(平均值±標準差)(%)

Tab.5 Apparent digestibility of amino acids of two groups

3 討論

3.1 飼料中添加益生元對促進動物生長的作用

益生元作為一種微生態調節劑，具有選擇性地促進有益菌的增殖、降低病原菌的致病力以及調節機體免疫系統等功能[21]，相比使用傳統抗生素所帶來的耐藥性、藥物殘留等風險，益生元是一種更為安全有效的促生長劑。目前，在很多水產飼料中都添加了各類益生元成分，周小秋等[22]研究了在基礎餌料中添加不同比例甘果寡糖對鯉魚生長的影響，其結果表明寡聚糖對鯉魚有顯著的促生長作用。蘇純陽等[23]研究了在基礎飼料中添加一定比例的益康素(寡聚糖類產品)對南美白對蝦生長性能的影響，試驗組在增重、成活率、飼料系數等指標上均與對照組有顯著差異。肖明松等[24]研究了在飼料中添加不同種類和含量的益生元對中華鱉生長、免疫功能和消化酶活力的影響，結果表明益生元有一定的促生長作用，并可以提高多種酶活力。本文所添加的乳源性益生元(百泰?-A)是由自溶性啤酒酵母、奶組分和曬干的發酵產物組成。Li等[25]研究了在雜交條紋鱸餌料中添加百泰?-A能提高其增重率。本試驗中，通過在基礎飼料中添加百泰?-A可以顯著提高三線閉殼龜的增重率和蛋白質效率，同時使飼料系數顯著降低。

3.2 益生元對促進營養物質吸收的作用

龜鱉和其他動物一樣，為滿足生理需要，要從飼料中攝取蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和無機鹽等營養物質，其中蛋白質是最重要的營養物質。從其生理作用來看，蛋白質是決定動物生長快慢的關鍵因素，Burr[26]研究發現，飼料中添加1%的百泰?-A能顯著提高美國紅魚(Sciaenopsocellatus)對高豆粕日糧蛋白質的表觀消化率，并能顯著促進其前腸上皮細胞和微絨毛發育，這是促進其對營養物質吸收的重要因素。而龜鱉對蛋白質的需要量，其實質是對氨基酸的需要，周小秋等[27-29]研究指出賴氨酸和蛋氨酸對水生生物蛋白質的合成起到關鍵作用，賴氨酸缺乏會降低鱉的生活力，導致其食欲下降、生長受阻，賴氨酸對鱉的增重、飼料系數、體蛋白沉積等指標影響極顯著(P<0.01)；而蛋氨酸水平對特定生長率、攝食量、飼料系數有極其顯著或顯著影響(P<0.01或P<0.05)。因此，賴氨酸或蛋氨酸缺乏引起攝餌量下降可能是導致蛋白合成能力下降的主要原因之一。本試驗中，在飼料中添加益生元雖然對總氨基酸消化率沒有影響，但對賴氨酸和蛋氨酸消化率卻造成顯著差異(P<0.05)，這可能是造成2組三線閉殼龜蛋白質合成、吸收及其他生長指標出現差異的重要原因。

3.3 單一性使用益生元的局限性

雖然很多研究[30-32]已證實益生元可以促進動物生長，有效提高動物的非特異性免疫。但也有很多國內外文獻[33-34]指出益生元對試驗對象的生長沒有起到促進作用，除了物種之間存在的生長差異，還可能與益生元本身的作用機制有關。益生元是選擇性地促進腸道有益微生物菌群的生長繁殖和代謝以及優化腸道有益微生物菌群的結構和豐度的。因此，如果沒有相應益生菌的參與，動物腸道內缺乏有益微生物菌群的話，單純使用益生元是無法競爭性抑制病原微生物的生長，而只能促進已有的有益菌群生長。因此，考慮到益生元的局限性，很多研究[35-37]已將益生菌和益生元的復合制劑(也稱為合生元)應用在動物養殖環節中，它的特點是高效配伍特定的益生菌和益生元，通過有針對性地促進外源性益生菌在動物腸道中定植和生長，并選擇性刺激內源有益菌群的增殖，調節免疫系統，改善動物腸道微生態群系平衡，起到益生菌和益生元的雙重作用，從而更好地促進動物的生長和健康。下一步，我們也將在現有基礎上，重點研究飼料中添加合生元對三線閉殼龜生長、非特異性免疫等方面的作用。

3.4 健康養殖模式的推廣對野生種群資源恢復的重要意義

物種的瀕危主要由環境因素、遺傳因素、經濟和社會發展因素所決定。對于瀕危物種的資源恢復來說，開展人工養殖是一種有效的保育手段，目前所倡導的健康養殖模式則是未來人工養殖技術的主要發展方向。它是一個系統工程，是一種可持續的發展模式，可以保障動物健康和經濟效益的同步發展，其主要涉及養殖配套設施、飼料管理、動物福利、疾病防治等方面。經過20多年的發展，三線閉殼龜的人工養殖已經逐漸走出了庭院式養殖，并向規模化、專業化、生態化方向發展。隨著健康養殖模式的不斷完善、推廣，已能夠滿足市場對三線閉殼龜的食用數量、質量安全性和營養價值的多重需求，減少對野生種群的利用和破壞。本文從飼料配比方面入手，初步研究了益生元對三線閉殼龜的作用，有助于提高生長性能，增強其抗病能力，并減少對抗生素的依賴，在一定程度上可以緩解經濟和社會發展因素對野生三線閉殼龜的壓力。該成果還可以應用于物種保育技術研究，對野生種群資源恢復有一定意義。

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