基于CHD基因和EE0.6基因遺傳多態鑒定白枕鶴、丹頂鶴性別研究報告

孫志明徐 琪徐 祿倪谷音王金美

(1.無錫市動物園管理處，無錫，214151；2.揚州大學動物科學與技術學院，揚州，225009)

白枕鶴(Grusvipio)是國家Ⅱ級保護動物，IUCN將其列為易危(VU)，丹頂鶴(Grusjaponensis)是國家Ⅰ級保護動物，IUCN將其列為瀕危(EN)，受到動物飼養、保護機構的高度重視和保護。這2種鶴均為單態性鳥，兩性形體相似，它們的性別無論是幼鳥還是成鳥都很難從外觀或行為上進行準確鑒定，在人工養殖時，給配對造成很大困難。目前這2種鶴無論是野外數量還是圈養數量都沒有明顯上升，圈養條件下成功地鑒定性別可人為提高鶴類配對指數和繁殖率。

目前在鶴類上常見性別鑒定方法主要有利用繁殖季行為特征觀察、泄殖腔翻檢、糞便中雌激素與睪酮比例的測定、染色體分析、內窺鏡探測等，但是這些方法準確度都不高，且有的傷害性大、有的費時費力。隨著鳥類基因組研究發展，多個基因在非平胸鳥類W、Z染色體上均存在差異，如染色體螺旋蛋白基因(Chromo-helicase-DNA-Binding gene，CHD)。該基因在非平胸鳥類上有2個同源拷貝CHD-W和CHD-Z，而兩者的外顯子序列和大小相似，但內含子大小卻有很大差別。又如EE0.6序列在W、Z染色體上有一段同源序列，但它們在大部分序列上卻存在差異。因此可根據W、Z染色體上基因序列差異來鑒別鳥類的性別[1-2]。與傳統方法相比，這種方法準確、快速、方便，對動物傷害小，在鑒定鳥類性別上起重要作用。

基于此，本研究以無錫市動物園飼養的白枕鶴和丹頂鶴為研究對象，分別運用CHD基因鑒定法和EE0.6序列鑒定法，并根據這一結果對白枕鶴、丹頂鶴進行配對，孵化，驗證這2種方法在鶴類性別鑒定中的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

樣本來自于無錫動物園圈養條件下的白枕鶴(5只，編號B1-B5)、丹頂鶴(3只，編號D1-D3)。利用乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素鈉方法收集全血樣本。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

按照禽血DNA抽提試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)說明書提取基因組DNA，利用蛋白質核酸分析儀檢測基因組DNA的含量和純度，保存于4℃備用。

1.2.2 引物設計

利用CHD基因內含子兩側保守序列，以及EE0.6序列W、Z染色體上的特異性片斷設計特異性引物，引物信息見表1。

1.2.3 PCR擴增與瓊脂糖凝膠電泳檢測檢測

PCR擴增的反應體系為20 μL，含10×Buffer(含Mg)2 μL、dNTPs(2.5 mM)2 μL、上下游引物(10 pmol/μL)各1μL、Taq酶(5U/μL)0.2 μL、模板DNA(100～200 ng/μL)1 μL、滅菌蒸餾水12.8 μL。反應條件為94℃ 5 min；94℃50 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，30個循環；72℃ 10 min。取5 μL PCR擴增產物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Gene Genius凝膠成像儀分析檢測擴增結果。

表1 CHD 和EE0.6引物信息

Tab.1 CHD and EE0.6 primer information

1.2.4 白枕鶴、丹頂鶴配對與孵化記錄

根據PCR鑒定結果，對白枕鶴、丹頂鶴配對，并記錄受精蛋和孵化率。

2 結果

2.1 白枕鶴、丹頂鶴性別鑒定結果

利用引物2550F/2718R對白枕鶴、丹頂鶴性染色體連鎖基因—CHD基因在W、Z兩個染色體上的同源部分進行擴增，結果見圖1。從圖1可以看出，B1、B2、B3、B4、D1、D2個體僅能擴增出1條帶，即為雄性，而B5、D3個體可擴增出2條帶，即為雌性。利用引物組合BW/FZ、CW/FZ、CW/DZ對白枕鶴、丹頂鶴EE0.6序列W、Z兩個染色體上的同源部分進行擴增，結果見圖2。從圖2可以看出，3對引物擴增結果一致，B1、B2、B3、B4、D1、D2個體僅能擴增出1條帶，即為雄性，而B5、D3個體可擴增出2條帶，即為雌性。從上可以看出，2種PCR鑒定方法結果一致。

圖1 CHD基因引物2550F/2718R擴增結果電泳圖Fig.1 Electrophoresis diagram of amplification result of CHD gene primer 2550F/2718R 注：B1、B2、B3、B4、B5為白枕鶴；D1、D2、D3為丹頂鶴；M：1 000 bp DNA Ladder Marker Note：B1、B2、B3、B4、B5 are white-naped crane；D1、D2、D3 are red-crowned crane；M：1 000 bp DNA Ladder Marker

圖2 EE0.6序列不同引物組合BW/FZ、CW/FZ、CW/DZ部分擴增結果電泳圖Fig.2 Electrophoresis diagram of partial amplification of BW/FZ，CW/FZ and CW/DZ in different combinations of EE0.6 sequences 注：B1、B2、B3、B4、B5為白枕鶴；D1、D2、D3為丹頂鶴；M：500 bp DNA Ladder Marker Note：B1、B2、B3、B4、B5 are white-naped crane；D1、D2、D3 are red-crowned crane；M：500 bp DNA Ladder Marker

2.2 白枕鶴、丹頂鶴配對與孵化結果

根據PCR鑒定結果，對白枕鶴、丹頂鶴配對，并記錄產蛋數，受精率和受精蛋孵化率(表2)。

表2 白枕鶴、丹頂鶴配對與孵化結果

Tab.2 Pairing and hatching results of white-naped cranes and red crowned cranes

3 討論

本研究分別利用CHD基因鑒定法和EE0.6序列鑒定法，對無錫動物園5只白枕鶴和3只丹頂鶴進行性別鑒定。2種鑒定方法的結果一致，B1、B2、B3、B4、D1、D2個體為雄性，B5、D3個體為雌性。CHD基因鑒定法和EE0.6序列鑒定法已先后在丹頂鶴、蓑羽鶴(Anthropoidesvirgo)、灰鶴(Grusgrus)、白鶴(Grusleucogeranus)、東方白鸛(Ciconiaboyciana)、黑冠鶴(Balearicapavonina)等珍稀鶴類擴增出不同的片段[3-5]，劉鑫等[6]曾嘗試利用EE0.6序列對白枕鶴的性別進行鑒定，張紅霞[7]也曾利用CHD基因引物2550F/2718R和EE0.6序列鑒別了白枕鶴、蓑羽鶴、黑冠鶴、丹頂鶴和灰鶴性別，盡管這些方法能對性別作出判斷，有利于珍稀鶴類的繁殖，但是真正在生產中應用案例還很少見。本研究為了驗證該方法的實際可操作性，根據PCR鑒定結果對白枕鶴、丹頂鶴進行配對，結果均成功孵化出后代，表明該PCR鑒定結果可靠。與傳統鑒定性別相比，該方法采樣量小，取樣容易，對鶴類應激反應也不大，相對安全；利用穩定遺傳的基因組DNA進行PCR擴增應用來鑒定性別，結果更可靠；鑒定不受年齡的限制，從剛出生到成年個體均可通過PCR鑒定性別；操作簡便、周期短，也易推廣。研究結果可為進入繁殖期鶴類進行配對提供了依據，避免了同性配對，從而提高繁殖效率，有效地保護物種。

[1] 陳武，謝淑敏，謝高基，等.PCR技術在鳥類性別鑒定上的應用[J].中國獸醫科學，2006，36(6)：485-488.

[2] 包文斌，胡飛，徐琪，等.鳥類性別鑒定的分子生物學方法[J].中國畜牧獸醫，2007，34(10)：33-36.

[3] 田秀華，劉鑄，何相寶，等.7種鶴形目鳥類性別的分子鑒定[J].動物學雜志，2006，41(5)：62-67.

[4] 劉鑄，田秀華，白素英.一種準確簡便的東方白鶴性別分子鑒定方法[J].野生動物，2006，27(3)：50-53.

[5] Itoh Y，Suzuki M，Ogawa A，et al.Identification of the sex of a wide range of Carinatae birds by PCR using primer sets selected from chicken EE0.6 and its related sequences[J].Journal of Heredity，2001，92(4)：315-321.

[6] 劉鑫，張紅霞，包文斌，等.白枕鶴性別的分子鑒定方法[J].揚州大學學報：農業與生命科學版，2009，30(1)：42-44.

[7] 張紅霞.鶴性別鑒定及線粒體遺傳多樣性與鶴系統發育分析[D].揚州：揚州大學，2008.