圈養虎遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及藥敏分析

陳茂金黃海玲付黨華黃 萃鄔向東*

(1.江西農業大學動科院，南昌，330045；2.南昌市動物園管理處，南昌，330006)

華南虎(Pantheratigrisamoyensis)是中國的十大瀕危動物之一、國家Ⅰ級保護動物，紅色物種名錄極度瀕危，在野外已滅絕。目前南昌市動物園飼養著20多只圈養華南虎，為更好保護該虎群，采集華南虎新鮮糞便，進行了細菌分離，通過擴增16S rRNA基因片段分析，確定分離到一株遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)。

該菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，愛德華氏菌屬。為革蘭氏陰性桿菌，無莢膜，是一種人畜共患病[1]病原。1962年首次由日本科學家Hoshina從發病鰻鱺(Anguillajaponica)體內分離發現[2]。該菌常發病于水產動物中，給水產養殖業帶來巨大的危害，造成不可估量的經濟損失；其他動物報道較少，尚無從虎腸道內分離發現的報道[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

華南虎糞便，采于江西南昌市動物園內一雌性成年華南虎新鮮糞便，糞便偏軟但成形，無其他可見臨床癥狀。

1.1.2 引物

根據細菌16S rDNA基因序列，設計特異性引物一對，由上海生工生物有限公司合成，引物序列如下：

16S(F)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

16S(R)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

1.1.3 主要試劑

小牛血清，杭州江濱生物技術有限公司；PCR Mix、100bp DNA Ladder購自北京全式金生物科技有限公司；飽和酚、溴化乙啶(EB)購自上海生工生物工程股份有限公司；膠回收試劑盒購自Omega；Tris堿購自Solarbio公司；SDS、Agarose購自Sigma公司。

1.1.4 主要設備

SW-CJ凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器、生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；5415R冷凍臺式高速離心機，Eppendorf；PCR儀，杭州晶格儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離

無菌操作將約5 g華南虎糞便放入燒杯，并加入95 mL無菌生理鹽水混勻做100倍稀釋；靜置10 min后，取上清做10倍剃度稀釋。選擇10-6、10-7、10-83個稀釋度用無菌棉簽蘸取糞便稀釋液涂布血清培養基，置37℃電熱恒溫箱中培養24 h。從培養基內勾取單個、孤立菌落，進行純化獲得菌株；從中選擇典型分離株進行16S rRNA基因的PCR擴增。

1.2.2 細菌16S rDNA鑒定

1.2.2.1 菌液制備

取7支無菌5 mL試管，每支加入3 mL LB液體培養基，分別將7個分離菌株挑單個菌落接種到LB液體培養基中37℃、150 r/min振蕩培養過夜。待培養基渾濁后停止振蕩，取出試管，供提取細菌DNA模板之用。

1.2.2.2 細菌DNA提取

取1 mL對數期菌液，12 000 rpm離心3 min棄上清。加入0.6 mL TE重懸細菌，12 000 rpm離心3 min棄上清，加入100 μL雙蒸水煮沸12～18 min；再12 000 rpm離心5 min，取上清即為提取細菌DNA模板，-20℃備用。

1.2.2.3 細菌16S rDNA PCR擴增

擴增體系(25 μL)：16S(F)，1.0 μL；16S(R)，1.0 μL；PCR Mix，12.5 μL；模板 DNA，1.0 μL；ddH2O，9.5 μL；Total 25.0 μL。

PCR 反應條件：按上述體系，將引物、PCR Mix、dNTP、細菌DNA模板依次加入無菌 0.2 mL EP管中，將EP管放入PCR儀，蓋好蓋子，調好擴增條件進行DNA擴增。94℃預變性5 min，進行擴增循環，擴增條件94℃ 40 s，55℃ 50 s，72℃ 50 s，33個循環；最后72℃延伸10 min結束擴增。

取出反應管，從中吸取6 μL在1%的瓊脂糖凝膠中，電泳30 min。在紫外分析儀下觀察擴增結果，并拍照記錄結果。

1.2.3 PCR擴增產物送檢測序

將PCR擴增的產物送至南京金斯瑞生物科技有限公司雙向測通測序。

1.2.4 序列分析

將測序得到的7個序列用NCBI中Blast工具進行相似性比較。根據比較的結果，選取參考菌株，采用MEGA6.05軟件，用N-J法、ML法、MP法進行系統發育樹的構建，并通過自舉分析進行置信度檢測，自舉數集為1 000。

1.2.5 分離菌株藥敏實驗

麥氏比濁法確定菌液細菌濃度對應3號標準管(約9×108/mL)，在血清培養基平板上進行紙片法藥敏實驗，37℃培養24 h后測量抑菌圈的直徑大小，按照中華人民共和國衛生行業標準中紙片法抗菌藥物敏感試驗標準來確定菌株對不同藥物的敏感性。

2 結果

2.1 細菌分離結果

分離細菌經純化培養獲得24個菌株；分離細菌在血清培養基37℃培養24 h后菌落形態大致相似：灰白色、半透明、中間略微凸起、邊緣整齊、表面光滑且濕潤；革蘭氏染色呈陰性，鏡檢呈短桿狀，無芽孢。從中選擇7個典型分離株進行PCR擴增，并分別命名為NCH01～NCH07。

2.2 細菌16S rDNA PCR擴增結果

7個分離菌株經過PCR擴增出約1 500 bp大小的基因片段(圖1)。

圖1 NCH01-NCH07分離菌株16S rDNA擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of 16S rDNA amplification product of NCH01-NCH07 isolated strain 注：M為100 bp DNA Ladder；1～7分別為菌株NCH01～NCH07 16S rDNA 擴增產物；8為陰性對照 Note：M is 100 bp DNA ladder；1-7 is the 16S rDNA amplification product of strain NCH01-NCH07；8 is a negative control

2.3 測序及序列分析結果

經過PCR擴增的7個分離菌株的16S rRNA基因測序后分別與GenBank中序列進行BLAST比對，結果顯示分離菌株NCH01、NCH02、NCH04、NCH05、NCH06、NCH07的16S rRNA基因與大腸桿菌(Escherichiacoli)的同源性均達到99%；而NCH03 16S rRNA基因與遲緩愛德華氏菌Su100菌株16S rRNA基因(AB050829.1)同源性達到100%(圖2)。分離菌株NCH03的16S rRNA基因片段長度為1 414 bp(圖3)。

選取遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、保科愛德華氏菌(Edwardsiellahoshinae)、鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)、沙門氏菌(Salmonellaenterica)、粘放線菌(Moritellaviscosa)、人肺炎桿菌(Cardiobacteriumhominis)菌株與分離菌株NCH03的16S rRNA基因采用鄰接法(Neighbor-Joining)、最大似然法(Maximum likelihood)、最大簡約法(Maximum parsimony)構建系統發育進化樹，結果都顯示分離菌株NCH03與遲緩愛德華氏菌屬于同一聚類分支，親緣關系最近。可確定分離菌株NCH03為遲緩德華氏菌(圖4)。

圖2 NCH03 16S rRNA基因與遲緩愛德華氏菌Su100菌株16S rRNA基因(AB050829.1)對比圖Fig.2 The Comparison Chart of NCH03 16S rRNA gene with Edwardsiella tarda strain Su100 16S rRNA gene(AB050829.1)

圖3 菌株NCH03 16S rRNA基因部分序列Fig.3 Part of the sequence of the strain NCH03 16S rRNA gene

(a)

(b)

(c)圖4 3種方法構建NCH03 16S rRNA基因系統發育樹(a.N-J法，b.ML法，c.MP法)Fig.4 Three methods of constructing NCH03 16S rRNA gene phylogenetic tree(a.Neighbor-Joining，b.Maximum likelihood，c.Maximum parsimony)

2.4 藥敏實驗結果

分離菌株NCH03對20種藥物敏感性測定結果如表1，結果表明：NCH03菌株對氨芐西林、阿莫西林、替卡西林-克拉維酸、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、頭孢噻肟、妥布霉素、氧氟沙星、呋喃妥因敏感；對卡那霉素中敏；對頭孢他啶、四環素、多西環素、紅霉素、阿奇霉素、林可霉素、復方新諾明、環丙沙星、諾氟沙星耐受。

表1 分離菌株NCH03對20種藥物的敏感性

Tab.1 Sensitivity of strain NCH03 to 20 kinds of drugs

注：S敏感；I中等敏感；R抗性

Notes：S Sensitive；I Intermediate；R Resistant

3 小結與討論

本實驗從華南虎新鮮糞便內隨機分離到24株菌株，選取7株菌株(命名為NCH01到NCH07)提取其DNA作為模板，通過擴增16S rRNA基因進行同源性分析，初步鑒定菌株NCH03為遲緩愛德華氏菌，其他6株菌株為大腸桿菌。采用菌株NCH03 16S rRNA基因序列進行了系統發育樹的構建，以進一步確認菌株NCH03分類地位。結果表明NCH03與遲緩愛德華氏菌同源性為100%且在系統發育樹上為一聚類，確定分離菌株NCH03為遲緩愛德華氏菌。NCH03菌株對20種藥物敏感性測定，結果顯示對10種藥物敏感，9種藥物耐受，一種藥物處于耐受于敏感之間。

本實驗旨在通過對新鮮華南虎糞便菌群進行人工培養和16S rRNA基因擴增測序鑒定，從而反映出華南虎腸道菌群構成情況。為判斷圈養華南虎腸道健康狀況提供依據。對實驗中分離到的一株遲緩愛德華氏菌進行藥敏實驗，實驗結果為該圈養華南虎治療遲緩愛德華氏菌感染用藥的選擇提供參考，能更好地保護該華南虎群，也為華南虎源遲緩愛德華氏菌后續研究奠定基礎。

遲緩愛德華氏菌廣泛分布在水環境中，既能感染多種海水淡水魚類，也能感染兩棲動物、爬行動物、哺乳動物等[1，4-6]。宣云峰等[7]從加州鱸(Micropterussalmoide)內分離出遲緩愛德華氏菌。鄧顯文等[8]從羅非魚(Oreochromisspp.)內分離鑒定了遲緩愛德華菌。周常義[9]等人從兩棲動物牛蛙(Ranacatesbeiana)分離到該菌。陳宗淦，陸亢興等[4-5]發現人感染遲緩愛德華氏菌的病例。目前尚無華南虎感染該菌的報道。

遲緩愛德華氏菌感染途徑較多，許多動物腸道和水體中都含有該菌，接觸帶毒動物糞便和飲用污染的水源，都可能被感染，從而顯現一些臨床癥狀[10]，嚴重危害動物和人的健康。如牙鲆(Paralichthysolivaceus)感染引起腹部膨脹，內有膿液狀腹水，肝腎腫大并伴有出血癥狀[11]；牛蛙感染引起腹水病[9]；海獅感染引起活動異常、采食量減少、無力等；人感染后可引起腸胃疾病、敗血癥等[10]。因此，飼養華南虎時應注意飼養環境衛生，勤打掃消毒，飼喂干凈水和食物，防止水和食物被該菌污染。這才能更好地保護華南虎。

目前遲緩愛德華氏菌病治療多以抗生素為主，容易產生耐藥性。本實驗中對華南虎糞便分離菌株NCH03進行藥敏實驗，結果顯示該菌對20種藥物中的10種耐藥，具有較強的耐藥性。這也加大了保護瀕危動物華南虎的難度。中藥防治疾病時具有副作用小、不易產生耐藥菌的特點。劉克奉等[12]研究了6種中藥對遲緩愛德華氏菌的抑制作用，為使用中藥防治該病提供了重要依據。

[1] 劉春，李凱彬，王慶，等.斑馬魚遲緩愛德華氏菌的鑒定、致病性及藥物敏感性[J].華中農業大學學報，2013，32(3)：105-111.

[2] 邵建春.黃鱔源遲緩愛德華氏菌的鑒定、分型及全基因組測序[D].武漢：華中農業大學，2016.

[3] 葉旭紅，林先貴，王一明.養殖澳洲寶石魚遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及致病基因的檢測[J].淡水漁業，2010，40(1)：50-54.

[4] 陳宗淦，朱江，魏威，等.遲緩愛德華氏菌敗血癥3例[J].大理醫學院學報，1998，7(3)：54-55.

[5] 陸亢興.愛德華氏菌致肝膿腫[J].臨床檢驗雜志，1990，8(3)：164.

[6] 吳斌，樊海平，曾占壯，等.歐洲鰻鱺肝腎病病原菌的分離與鑒定[J].中國海洋大學學報：自然科學版，2010，40(11)：51-56.

[7] 宣云峰，沈勇亮，楊小猛，等.加州鱸遲緩愛德華氏菌病的檢測和防治[J].水產養殖，2014，35(10)：8-10.

[8] 鄧顯文，謝芝勛，劉加波，等.羅非魚遲緩愛德華氏菌的分離與鑒定[J].水生態學雜志，2009，2(1)：114-117.

[9] 周常義，陳曉鳳，何仲京.牛蛙遲緩愛德華氏菌變異株K的分離與鑒定[J].集美大學學報：自然科學版，2004，9(1)：26-31.

[10] 王波，莫照蘭.遲緩愛德華氏菌及其致病機理[J].海洋科學集刊，2007，48：133-139.

[11] 張浴陽，王維娜，王軍霞，等.牙鲆愛德華氏菌病的研究[J].水產科學，2003，22(1)：34-36.

[12] 劉克奉.6種中草藥對2株致病菌的抑菌效果比較[J].水產養殖，2013，34(10)：49-54.