寒凝血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的制備

叢慧芳，谷栩萌，張?zhí)鞁龋瑒⑼瑒⒀缇邚姡湮涅i*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮體以外的部位[1]。它是婦科臨床中的常見病、疑難病。其最主要的臨床表現(xiàn)是繼發(fā)性痛經(jīng)及不孕，無論何種表現(xiàn)都嚴(yán)重威脅了廣大育齡女性的身心健康，故針對子宮內(nèi)膜異位癥的病因病機及治療研究已成為醫(yī)學(xué)界的重要課題，因此制備與臨床患者相近的動物模型極為重要。導(dǎo)師叢慧芳教授從“伏寒傷腎，致瘀損絡(luò)”[2]這一理論認(rèn)識子宮內(nèi)膜異位癥，闡述了本病的發(fā)病原因及疾病表現(xiàn)，本課題組結(jié)合臨床患者實際患病過程，將前人造模方法改良，采取冰水浸泡加藥物法，先建立寒凝血瘀動物模型，再采取自體子宮內(nèi)膜移植加冰水浸泡法，建立病癥結(jié)合的寒凝血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥模型，意在為子宮內(nèi)膜異位癥的研究做微薄力量。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡健康的SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0003。將大鼠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院實驗室2周后再給予造模，室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度45%～55%，每日光照12 h，自由飲食、飲水，使所有大鼠處于同樣的環(huán)境下并適應(yīng)該飼養(yǎng)環(huán)境。

1.2 主要試劑、耗材與儀器

鹽酸腎上腺素(遂成藥業(yè)股份有限公司，批號：1611251);苯甲酸雌二醇注射液(四川金科藥業(yè)有限公司，批號：220412511);10%水合氯醛注射液，碘伏消毒液(上海利康消毒高科技有限公司，批號：20161115);0.9%氯化鈉注射液(華仁藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：H51023935);硫酸慶大霉素注射液(林州市亞神制藥有限公司，批號：H41022646);10%甲醛溶液;石蠟(上海華永石蠟有限公司);二甲苯(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司);中性樹脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇(北京化工廠);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

一次性使用血樣采血針;肝素鈉NH真空采血管;枸櫞酸鈉1∶9真空采血管;1 mL和5 mL注射器;普通眼科手術(shù)器械。

南京志倫全自動血流變測試儀;SYSMEX全自動血液凝固儀德國Leica ASP300全自動脫水機;RM2135型切片機;上海一恒電熱恒溫箱;-80 ℃低溫冰箱。

1.3 實驗動物分組

1.3.1 寒凝血瘀型大鼠模型的制備

選取SD大鼠24只，隨機分為冰水浴7 d組8只，冰水浴14 d組8只，空白對照組8只。

1.3.2 寒凝血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的制備

根據(jù)造模時間，將大鼠分為空白對照組、術(shù)后3 d組、術(shù)后5 d組、術(shù)后1周組、術(shù)后2周組、術(shù)后3周組、術(shù)后4周組、術(shù)后6周組、術(shù)后8周組及術(shù)后12周組。

1.4 動物模型制備

1.4.1 寒凝血瘀型大鼠模型的制備

SPF級SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，每日上午9點置于0～1 ℃冰水混合物中浸泡8 min，當(dāng)大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、腿部僵直欲沉或呼吸微弱時取出，每日1次，冰水中撈出后迅速用干毛巾擦拭，同時電動吹風(fēng)機吹至干爽，注意保溫。分別于冰水浴7 d及14 d當(dāng)天，皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg，共兩次，間隔4 h，2次之間將大鼠置于0～1 ℃冰水中浸泡5 min，末次造模后12 h內(nèi)禁食不禁水。第二日觀察大鼠的耳、舌及舌下脈絡(luò)，并于麻醉狀態(tài)下，開胸，充分暴露大鼠心臟，采血針刺入心尖，另一端插入真空管，取4 mL血注入肝素鈉NH真空采血管；取2 mL血注入枸櫞酸鈉1∶9真空采血管，分別于全自動血流變測試儀及全自動血液凝固儀行血流變及凝血功能檢測，以確定大鼠寒凝血瘀模型建立成功的時間。

1.4.2 寒凝血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的制備

取76只健康6周齡SPF級雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后，行冰水浴2周后給予腎上腺素注射(具體方法同前)，冰水浴期間，每日8時給大鼠行陰道涂片檢查，以觀察大鼠的動情周期，選擇出現(xiàn)至少2個連續(xù)且規(guī)律的動情周期的大鼠，冰水浴滿2周后，擇動情期，采用經(jīng)典的手術(shù)方法對大鼠子宮內(nèi)膜進(jìn)行移植，按孫博[3-4]等人。

空白對照組大鼠為假手術(shù)，僅開腹找到子宮，再用生理鹽水沖洗腹腔，最后縫合腹壁。術(shù)后給予每只大鼠硫酸慶大霉素注射液腹腔注射0.1 mL/d，連續(xù)3 d，各模型組每只大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.1 mL/(kg·d)，連續(xù)3 d。所有大鼠正常清潔飼養(yǎng)，并于手術(shù)1周后，將縫合刀口處貼醫(yī)用防水膠布，于每日上午9時置于0～1 ℃冰水混合物中浸泡8 min，日1次，連續(xù)1周，每次水中撈出后毛巾擦拭，同時電動吹風(fēng)機吹至干爽，注意保溫。大鼠實驗過程中，溺水死亡2只，麻醉后死亡1只，術(shù)中死亡1只，術(shù)后感染死亡1只，術(shù)后傷口咬開后死亡4只。余大鼠分別于術(shù)后3 d、5 d、1周、2周、3周、4周、6周、8周、12周，選取6只大鼠。于麻醉狀態(tài)下，采血行血流變及凝血功能檢測(采血方法同前)。取血完畢后開腹，找到移植病灶處，行大體外觀觀察，各手術(shù)組大鼠取異位內(nèi)膜連同下方肌層約0.5 cm×0.5 cm的組織，空白對照組大鼠取子宮段0.5 cm，從中間剪開，分別放在10%甲醛溶液中保存，以行病理學(xué)觀察。

1.5 成模標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 寒凝血瘀型大鼠模型成模標(biāo)準(zhǔn)

(1)中醫(yī)證候：大鼠出現(xiàn)畏寒喜暖，背弓毛枯，蜷縮少動，食少便溏，爪甲、耳緣紫暗、舌質(zhì)紫暗、舌下脈絡(luò)增粗色暗等寒凝血瘀證的癥狀[5]。(2)實驗室指標(biāo)：血流變和凝血功能檢查有相應(yīng)變化[6]。

1.5.2 寒凝血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型成模標(biāo)準(zhǔn)

(1)具備上述寒凝血瘀證的證候表現(xiàn)及實驗室指標(biāo)；(2)肉眼觀察移植物呈囊泡樣結(jié)構(gòu)，囊泡內(nèi)含淡黃色清亮的或咖啡色的液體，囊泡表面及周圍可見血管形成；(3)病理學(xué)觀察：異位組織可見明顯的子宮內(nèi)膜上皮及基質(zhì)，層次清晰，表面上皮呈柱狀，基質(zhì)呈少許纖維化，可見多量微血管形成[7]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 寒凝血瘀型大鼠模型的實驗結(jié)果

2.1.1 大鼠造模不同時間的中醫(yī)證候表現(xiàn)

本實驗采用冰水浸泡加皮下注射鹽酸腎上腺素法制備寒凝血瘀型大鼠。空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，飲食及二便正常，皮毛緊貼于身體并且有光澤感，耳廓血管清晰無增粗且顏色鮮紅，舌質(zhì)粉紅，舌下脈絡(luò)細(xì)小且顏色無加深；冰水浴7 d組大鼠出現(xiàn)畏寒、飲水增多等表寒證；冰水浴14天組大鼠出現(xiàn)畏寒喜暖，背弓毛枯，蜷縮少動，食少便溏，爪甲、耳緣紫暗，舌質(zhì)紫暗，舌下脈絡(luò)增粗且色暗等寒凝血瘀證癥狀。

2.1.2 各組大鼠實驗室指標(biāo)變化

2.1.2.1 出凝血時間

冰水浴7 d組、冰水浴14 d組的凝血酶原時間(PT)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(PT-INR)、部分凝血活酶時間(TT)均明顯低于空白對照組；纖維蛋白原(FIB)明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(見表1)

表1 各組大鼠的出凝血時間比較

注：與空白組比較，*P<0.05

2.1.2.2 血流變

冰水浴7天組、冰水浴14天組的低切、中切、高切、血漿黏度、全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、全血相對指數(shù)(低切)、全血相對指數(shù)(高切)均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。冰水浴14天組與冰水浴7天組比較，低切、高切、血漿黏度均高于冰水浴7天組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；二者比較，中切、全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、全血相對指數(shù)(低切)及全血相對指數(shù)(高切)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2～3。

表2 各組大鼠的血流變—血漿黏度比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與冰水浴7天組比較，#P<0.05

表3 各組大鼠的血流變—紅細(xì)胞系列比較

注：與空白組比較，*P<0.05

2.2 寒凝血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的實驗結(jié)果

2.2.1 大鼠造模情況

本課題組選用冰水浸泡加皮下注射腎上腺素法建立寒凝血瘀大鼠模型，隨后采用自體子宮內(nèi)膜移植加冰水浸泡的方法建立病證結(jié)合的寒凝血瘀型EMs大鼠模型。本次參加造模大鼠為70只，除造模過程中死亡者，余62只大鼠，腹壁出現(xiàn)膿包2只，病灶曾黃色纖維素樣3只；腹壁出現(xiàn)瘀血塊2只，此次造模共成功55只，造模成功率78.6%。

2.2.2 各組大鼠中醫(yī)證候表現(xiàn)

除術(shù)后12周組外，各模型組大鼠皆出現(xiàn)了前文描述的寒凝血瘀的中醫(yī)癥候表現(xiàn)；術(shù)后12周組大鼠精神狀態(tài)尚可，皮毛缺少光澤，耳廓周圍血管清晰但顏色暗紅，舌黯、舌下脈絡(luò)顏色略深；空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，飲食及二便正常，皮毛緊貼身體且有光澤，耳廓周圍血管清晰無增粗且顏色鮮紅，舌質(zhì)粉紅，舌下脈絡(luò)細(xì)小且顏色不深。

2.2.3 各組大鼠病灶大體外觀

分別于術(shù)后3 d、5 d、1周、2周、3周、4周、6周、8周及12周對大鼠子宮內(nèi)膜移植處進(jìn)行大體觀察，術(shù)后3 d移植物與移植部位可見部分融合；術(shù)后5 天可見二者完全融合，病灶周圍有炎性反應(yīng)，病灶表面可見新生血管；術(shù)后1周與術(shù)后5 d基本無差別；術(shù)后2周移植物體積增大；術(shù)后3周與術(shù)后2周相比移植物體積增近囊泡樣，其內(nèi)可見透明或淡黃色液體；術(shù)后4周與術(shù)后2周相比移植物體積明顯增大且呈囊泡狀，表面可見清晰血管，囊泡內(nèi)可見淡黃色或咖啡色液體，部分移植物與周圍組織粘連；術(shù)后6周與術(shù)后4周比較無明顯差異，個別病灶可見體積略贈大，囊泡內(nèi)液體較渾濁，表面血管增多，與周圍組織粘連情況無變化；術(shù)后8周與術(shù)后6周相比，肉眼觀察無明顯區(qū)別，偶見個別病灶縮小；術(shù)后12周與術(shù)后8周比，肉眼觀察無明顯區(qū)別，個別病灶顏色加深或縮小。見圖1。

圖1 各組大鼠病灶大體外觀

2.2.4 各組大鼠病灶的病理觀察

空白對照組，子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞整齊連續(xù)，呈長柱狀排列，可見多量間質(zhì)細(xì)胞，腺體和血管豐富；術(shù)后3天，組織嚴(yán)重水腫，間質(zhì)細(xì)胞少，僅見炎性細(xì)胞散在于間質(zhì)中；術(shù)后5天，異位組織還未形成完整內(nèi)膜上皮結(jié)構(gòu)，間質(zhì)細(xì)胞相對增多，以炎細(xì)胞為主，可見毛細(xì)血管增生，但間質(zhì)結(jié)構(gòu)較松散，與術(shù)后3天比較，組織水腫減輕；術(shù)后1周，異位組織形成完整的內(nèi)膜上皮結(jié)構(gòu)，見大量炎細(xì)胞，可見結(jié)締組織增生，組織水腫明顯減輕；術(shù)后2周，內(nèi)膜腺體形成，炎細(xì)胞明顯減少，水腫進(jìn)一步減輕，結(jié)締組織增生；術(shù)后3周，接近正常的子宮內(nèi)膜組織形態(tài)，炎細(xì)胞減少，水腫消失；術(shù)后4周，移植物已經(jīng)形成典型的子宮內(nèi)膜組織形態(tài)，內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈柱狀排列，偶有假復(fù)層結(jié)構(gòu)，但與正常的子宮內(nèi)膜相比較，間質(zhì)細(xì)胞及腺體數(shù)量增多，腺上皮呈立方排列，且血管豐富；術(shù)后6周與術(shù)后4周比較，上皮細(xì)胞排列更為緊密，間質(zhì)致密，細(xì)胞數(shù)量更多；術(shù)后8周，異位組織結(jié)構(gòu)與術(shù)后6周相似，上皮細(xì)胞呈柱狀生長，間質(zhì)細(xì)胞和腺體數(shù)量基本無變化，血供豐富；術(shù)后12周：與術(shù)后8周比較無明顯變化，仍具有典型的子宮內(nèi)膜組織形態(tài)，偶見疏松結(jié)締組織。見圖2。

2.2.5 各組大鼠的實驗室指標(biāo)變化

2.2.5.1 出凝血時間

各組出凝血時間情況，除術(shù)后12周組，其余各組與空白組比較，出凝血酶原時間、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值及部分凝血活酶時間均明顯下降，纖維蛋白原明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后12周組與空白組比較，出凝血酶原時間、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；部分凝血活酶時間及纖維蛋白原均無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

圖2 大鼠病灶的病理觀察(HE×200)

組別n凝血酶原時間(PT)國際標(biāo)準(zhǔn)化值(PT-INR)部分凝血活酶時間(TT)纖維蛋白原(FIB)空白組613．46±0．521．14±0．5122．49±0．771．56±0．10術(shù)后3d組67．83±0．44?0．67±0．03?15．07±0．42?1．85±0．06?術(shù)后5d組68．03±0．23?0．69±0．02?14．90±0．24?1．86±0．05?術(shù)后1周組67．83±0．52?0．67±0．01?14．90±0．09?1．87±0．04?術(shù)后2周組67．70±0．89?0．65±0．18?14．63±0．21?1．89±0．05?術(shù)后3周組68．30±0．39?0．71±0．32?15．13±0．05?1．90±0．03?術(shù)后4周組67．81±0．13?0．67±0．11?15．10±0．17?1．93±0．13?術(shù)后6周組68．00±0．19?0．70±0．03?14．87±0．21?2．02±0．18?術(shù)后8周組67．99±0．47?0．68±0．04?15．52±0．64?1．96±0．02?術(shù)后12周組614．12±0．94?1．22±0．13?22．7±1．081．64±0．04

注：與空白組比較，*P<0.05

2.2.5.2 血流變

各組血流變情況，除術(shù)后12周組，其余各組與空白組比較，各項指標(biāo)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后12周組與空白組比較，低切、中切、高切、血漿黏度及紅細(xì)胞聚集指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；全血相對指數(shù)(低切)及全血相對指數(shù)(高切)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5～6。

表5 各組大鼠的血流變—血漿粘度比較

注：與空白組比較，*P<0.05

表6 各組大鼠的血流變—紅細(xì)胞系列比較

注：與空白組比較，*P<0.05

2.3 結(jié)論

綜合各組大鼠的中醫(yī)證候、出凝血時間及血流變發(fā)現(xiàn)，冰水浴2周+鹽酸腎上腺素皮下注射，可以成功制備寒凝血瘀型大鼠模型。

根據(jù)上述病理結(jié)果，結(jié)合實驗室指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后4周組可以作為寒凝血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥的動物模型，同時該模型具有穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性至少可以持續(xù)到術(shù)后8周，術(shù)后12周雖無寒凝血瘀證的表征，但異位病灶確持續(xù)存在。

3 討論

中醫(yī)動物模型是在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，對人類疾病的某些特征進(jìn)行復(fù)制或模擬，來制備的符合人類疾病和證的實驗動物模型[6]。本課題團(tuán)隊查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]并結(jié)合地域性，提出了寒凝血瘀型為子宮內(nèi)膜異位癥的主要證型，導(dǎo)師叢慧芳教授針對此證型首創(chuàng)“伏寒傷腎，致瘀損絡(luò)”[2]這一理論，從中醫(yī)角度解釋了本病的發(fā)病原因及疾病表現(xiàn)。本課題針對本病的發(fā)生發(fā)展，模擬人類發(fā)病過程，進(jìn)行大鼠模型的建立。臨床子宮內(nèi)膜異位癥患者患病具有隱匿性及潛伏性，在青少年中，該病從出現(xiàn)臨床癥狀到確診，一般需要(2.96±2.93)年[10]，而在生育年齡婦女一般需要8～11年[11]，故患者通常是先有臨床癥狀，隨后數(shù)年經(jīng)超聲或腹腔鏡下證實患有子宮內(nèi)膜異位癥，也就是說患者存在寒凝血瘀證的證候表象后，逐漸自我積聚，日益而成子宮內(nèi)膜異位癥。故本課題模擬疾病發(fā)生發(fā)展的過程，先建立寒凝血瘀證大鼠模型，在寒凝血瘀大鼠模型的基礎(chǔ)上，建立子宮內(nèi)膜異位癥模型，更符合本病的病機演變規(guī)律。為了使證型更穩(wěn)定，故術(shù)后1周后，再次將大鼠冰水浸泡1周，也與臨床患者體內(nèi)持續(xù)存在寒凝血瘀之病因相符合。

對于寒凝血瘀模型建立，冰水浸泡持續(xù)時間的選擇，多篇文獻(xiàn)[12-13]提示冰水浸泡2周后，證型最穩(wěn)定，可以用于寒凝血瘀證的研究，本課題組實驗結(jié)果與前人所述一致，故冰水浸泡時間持續(xù)2周。

寒凝血瘀模型建立時，對于腎上腺素的應(yīng)用問題的考慮，部分學(xué)者[4,14]單純采用冰水浸泡法建立寒凝血瘀模型，部分學(xué)者[5,15]采用冰水浸泡加皮下注射腎上腺素法。本課題組考慮，用冰水浸泡的方法刺激大鼠，興奮了大鼠的交感神經(jīng)，反射性的引起血管收縮，使大鼠生理功能出現(xiàn)代償性增強，出現(xiàn)表寒發(fā)熱的代謝亢進(jìn)的癥狀，如寒戰(zhàn)發(fā)熱，飲水增多等，隨著冰水浸泡的持續(xù)，到第2周機體處于失代償狀態(tài)，表現(xiàn)為倦怠蜷縮，背弓毛枯，寒戰(zhàn)，不發(fā)熱，嚴(yán)重者反應(yīng)遲鈍，呼吸微弱。因為持續(xù)的寒冷刺激使機體發(fā)生微循環(huán)障礙，此時結(jié)合鹽酸腎上腺素皮下注射，誘導(dǎo)了血小板及紅細(xì)胞聚集,使血液的凝聚狀態(tài)加劇。本方法是在中醫(yī)“寒邪致瘀”的病因病機基礎(chǔ)上，結(jié)合血瘀的病理生理改變而設(shè)，故采用冰水浸泡加皮下注射腎上腺素法造模可以使該模型更穩(wěn)定。

本課題創(chuàng)新點：模擬臨床子宮內(nèi)膜異位癥患者疾病發(fā)生發(fā)展過程，先造成寒凝血瘀模型，再手術(shù)自體移植子宮內(nèi)膜組織；寒凝血瘀模型的建立采用了冰水浸泡加皮下注射腎上腺素法；移植后，分別于3 d、5 d、1周、2周、3周、4周、6周、8周、12周動態(tài)觀察大鼠移植病灶大體情況、病理變化及實驗室指標(biāo)變化情況，對寒凝血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的演變做動態(tài)記錄。本課題為子宮內(nèi)膜異位癥的動物研究提供了實際且可靠的造模方式及造模時間，為病證結(jié)合的子宮內(nèi)膜異位癥造模提供了新方法。

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