血清中IncRNA-PVT1的檢測(cè)方法建立及在肝癌診斷中的應(yīng)用

朱怡卿

【摘要】目的：建立在血清中檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，IncRNA）PVt1的方法，并探討該檢測(cè)在肝癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法：收集肝癌患者血清樣本50例，正常志愿者血清樣本40例，10對(duì)肝癌及癌旁組織樣本。分別通過(guò)TRIzol和TRIzo LS提取組織和血清中的RNA，通過(guò)real-time PCR檢測(cè)組織和血清中IncRNA-PVTl的相對(duì)含量。結(jié)果：IncRNA-PVTl在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P<0.01），IncRNA-PVT1在肝癌患者的血清中的表達(dá)顯著高于正常患者。結(jié)論：成功建立了在血清中檢測(cè)IncRNA-PVTl的方法，血清中IncRNA-PVTl的表達(dá)可以作為肝癌診斷的生物標(biāo)志。

【關(guān)鍵詞】血清;檢測(cè);肝癌

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)報(bào)道，全球每年有超過(guò)60萬(wàn)肝癌患者去世[1]。盡管外科治療技術(shù)及放、化療技術(shù)的進(jìn)步極大地改善了肝癌患者的預(yù)后，但是當(dāng)前針對(duì)肝癌的有效的治療手段依然十分有限，肝癌患者，特別是晚期肝癌患者的術(shù)后生存率依然不樂(lè)觀[2]。早期診斷和靶向治療是腫瘤治療的新方向，因此，發(fā)掘與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的分子標(biāo)志對(duì)肝癌的治療具有重要的意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-codingRNA，IncRNA）是指長(zhǎng)度超過(guò)200bp的一類非編碼RNA分子[3]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明，IncRNA在物種間的表達(dá)具有較高的保守性和時(shí)空特異性，可通過(guò)吸附內(nèi)源性的miRNA，結(jié)合蛋白質(zhì)等方式廣泛的參與生命活動(dòng)調(diào)控[4]。同時(shí)，大量研究表明IncRNA表達(dá)的紊亂與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前，已有研究表明IncRNA-PVTI在肝癌組織中特異性高表達(dá)，并可通過(guò)調(diào)控NOP2蛋白的穩(wěn)定性、特異性吸附miRNA參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，是肝癌早期診斷和靶向治療的潛在生物標(biāo)志。然而，血清中檢測(cè)IncRNA-PVTl的檢測(cè)方法，及其在肝癌診斷中的意義仍無(wú)報(bào)道。因此，本研究擬從肝癌中特異性高表達(dá)的原癌基因IncRNA-PVT1入手，建立在血清中檢測(cè)IncRNA-PVT1的方法，評(píng)價(jià)血清中IncRNA-PVTl表達(dá)檢測(cè)對(duì)肝癌診斷的意義。

1 樣本與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 臨床樣本

臨床樣本取自2016年至2017年期間在第二軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院東方肝膽醫(yī)院就診的肝癌患者及正常志愿者，在納入排除標(biāo)準(zhǔn)下共收集到10對(duì)肝癌及癌旁組織，50例肝癌患者血清及40例正常健康志愿者血清。

1.2 RNA提取

采用TRIzol LS試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取血清中的RNA。按照說(shuō)明書(shū)提取，最終凍存于-80℃。采用TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取組織中的RNA。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，最終用35μL無(wú)酶水溶解RNA，凍存于-80℃。

1.3 real-time PCR檢測(cè)

采 用PrimeScriptTM RT Reagent Kitwith gDNA Eraser試劑（大連TaKaRa公司）對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBRPremix Ex Taq II試劑（大連TaKaRa公司）對(duì)合成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL。IncRNA-PVTl的5對(duì)不同區(qū)段的引物如下：Pl上游引物5'-CGCTTCGCAGTGGAATGGAA-3'，Pl 下 游 引 物5-CC-GTGGCA-TTTCTGGTCTTGT-3：P2上游 引 物5'AAGACGGGCA-CTCACAGACA-3，P2下游引物5'AGC-GTTCTCTGGGCGTTCAT-3：P3上游弓I物5'ACAGAGTCCGTTCAGTGTCAGA-3'，P3 下 游 引 物5'ATT-GGGCTGG-GTCTACACAAGT-3'; P4 上游 引 物5'TGC-TTCGTGCTGATTCCTAGAC-3'，P4下 游 引 物5'TTGC-TCTGTGCTGCCAGTTAG-3'; P5上游引物5'GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3'，P5下 游 引 物5'ACAC-AAAGTGCATACCTACCCA-3'。GAPDH 的引 物 如下：上游5'-TGAAGGTCGGAGTCAACG GATT-3，下 游5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Mann-Whitney分析比較IncRNA-PVT1在肝癌患者血清、志愿者血清中的表達(dá)差異，采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較IncRNA-PVT1在肝癌、癌旁組織中表達(dá)的差異。使用GraphPad Prism 6.0（ Graphpad SoflwareInc，Caligomia）軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 IncRNA-PVTl片段在血清中表達(dá)的檢測(cè)

考慮到IncRNA-PVTl長(zhǎng)度為1957bp，在外周血中多以片段的形式存在，所以我們針對(duì)IncRN-PVTl的不同區(qū)域設(shè)計(jì)了5對(duì)檢測(cè)引物進(jìn)行檢測(cè)。分別采用這5對(duì)引物，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)5例肝癌患者和5例正常志愿者血清中IncRNA-PVTl的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物l，4，5均能在血清中檢測(cè)到IncRNA-PVT1表達(dá)， 而引物2，3未能檢測(cè)到IncRNA-PVTl的表達(dá)（圖1）。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，引物5檢測(cè)到的正常志愿者和肝癌患者血清中的IncRNA-PVTI具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），所以，我們選擇引物5進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 IncRNA-PVTl片段在肝癌患者血清中高表達(dá)

為了明確引物5在組織及血清中檢測(cè)IncRNA-PVTl表達(dá)的有效性，我們收集了10對(duì)肝癌及癌旁組織樣本，以及50例肝癌患者血清和40例正常志愿者血清樣本。結(jié)果顯示，10例組織樣本中，8例肝癌組織中IncRNA-PVTl呈顯著高表達(dá)（P<0.05，圖2A），且肝癌患者血清中IncRNA-PVTl的表達(dá)顯著高于正常志愿者（P>0.01，圖2B）。提示血清中IncRNA-PVT1的表達(dá)值可能用于檢測(cè)結(jié)腸癌。

3 討論

近年來(lái)，大量研究顯示IncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，是潛在的腫瘤早期診斷標(biāo)志物及腫瘤靶向治療靶點(diǎn)。其中，IncRNA-PVTI是一種廣泛報(bào)道的癌胚分子，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但少有文獻(xiàn)報(bào)道IncRNA-PVTl在腫瘤患者血清中的表達(dá)。有研究提示，外周血中難以檢測(cè)到IncRNA主要是由于IncRNA的長(zhǎng)度較長(zhǎng)，在血液中不穩(wěn)定且易斷裂，而主要以片段的形式存在于外周血中。Wang等的研究采用多對(duì)引物對(duì)IncRNA進(jìn)行擴(kuò)增后，發(fā)現(xiàn)IncRNA的部分片段確實(shí)呈高表達(dá)且穩(wěn)定地存在于外周血中。因此，本研究設(shè)計(jì)了5對(duì)針對(duì)IncRNA-PVTl不同區(qū)段的引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物5的擴(kuò)增效果最為明顯，而引物2和引物3都未能檢測(cè)出IncRNA-PVTl在血清中的表達(dá)，該研究結(jié)果表明，在血清中IncRNA-PVTl缺失可能以片段形式存在。采用引物5檢測(cè)IncRNA-PVTl在組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大部分組織中IncRNA-PVT1呈高表達(dá)。進(jìn)一步采用較大樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IncRNA-PVTl在結(jié)腸癌患者血清中的表達(dá)顯著高于正常志愿者，提示血清中IncRNA-PVTl的高表達(dá)可能是診斷肝癌的潛在生物標(biāo)志。

綜上所述，本研究建立了穩(wěn)定的在血清中檢測(cè)IncRNA-PVTl表達(dá)的方法，檢測(cè)結(jié)果表明肝癌患者血清中IncRNA-PVTl的表達(dá)顯著高于正常志愿者，提示血清中IncRNA-PVTl的表達(dá)值可能作為生物標(biāo)志

診斷肝癌。

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