抗真菌藥單用及聯合體外抗皮炎外瓶霉生物膜效應

鄭文倩 孫毅 高露娟 鄔清芝 李明 曾同祥

434100湖北荊州，長江大學（鄭文倩）；長江大學第二臨床醫學院 荊州市中心醫院皮膚科（孫毅、鄔清芝、曾同祥）；復旦大學附屬中山醫院皮膚科（高露娟、李明）

皮炎外瓶霉是暗色絲孢霉病的常見致病菌之一［1］，可引起皮膚、皮下組織感染，偶可致系統性播散性感染，在亞洲人群以中樞神經系統感染多見，死亡率高達90%［2-3］。生物膜形成不僅是侵襲性感染發展的先決條件，同時也與80%的非急性感染相關［4］。與游離態真菌相比，生物膜對多數抗真菌藥物耐藥，是臨床療效欠佳的潛在原因［4］。為了評估皮炎外瓶霉生物膜的抗真菌藥物敏感性，開發可能的藥物聯合方案，我們用96孔板構建皮炎外瓶霉生物膜，以棋盤式微量液基稀釋法評估抗真菌藥物單用及聯合抗皮炎外瓶霉生物膜的效果。

一、材料和方法

1.實驗菌株：皮炎外瓶霉菌株5株，質控菌株為近平滑念珠菌（ATCC22019），所有菌株均于實驗前用沙氏培養基活化1周，以保證受試真菌的活力與純度。所有皮炎外瓶霉菌株均分離自臨床患者，并經形態學和分子生物學方法鑒定。

2.抗真菌藥：伊曲康唑（批號84625-61-6，純度＞99%）、伏立康唑（批號137234-62-9，純度＞99%）、兩性霉素B（批號1397-89-3，純度 ＞80%）和卡泊芬凈（批號179463-17-3，純度＞97%）均由美國Sigma公司生產。使用分析純二甲基亞砜將藥物溶解成儲存液，濃度均為1 600mg/L。

3.構建皮炎外瓶霉生物膜：通過改良的96孔板法構建皮炎外瓶霉生物膜［5-6］。從沙氏培養基上收集孢子，用20ml RPMI1640培養基重懸，并調至1×107/m l菌懸液；在96孔板加入200μl上述孢子懸浮液，于37℃培養72 h；去上層培養基，避免破壞底部生物膜。磷酸鹽緩沖液清洗3次。

4.體外單藥藥物敏感性測試：參考美國臨床實驗室標準化研究所（Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI）頒布的M38-A2方案［7］，制備抗真菌藥物溶液，伊曲康唑、伏立康唑和卡泊芬凈終濃度為0.25～32mg/L，兩性霉素B終濃度為0.125～8mg/L。倍比稀釋后，將受試藥物加入96孔板，每孔加入100μl，同時設立陽性對照（無藥孔區）和陰性對照（無菌孔區），37℃孵育72 h。每孔加入100μl3，3′-［1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑］-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉（XTT）/甲萘醌混合溶液，孵育4 h后，于每孔中取80μl上清液，轉移到新的96孔板，并在490 nm處讀取吸光度（A值）［8］。所有實驗均重復3次。生物膜最低抑菌濃度（SMIC）50和SMIC80定義為：與對照組相比，其A值減少50%或80%的抗真菌藥物濃度［7］。

5.體外聯合藥物敏感性測試：采用棋盤法［8］。在含有生物膜的96孔板中分別加入不同的兩種藥物，自左向右1～8列為聯合區，每孔加入2倍終濃度藥物倍比稀釋液各50μl；第9、10列為單獨用藥區，藥物終濃度梯度同聯合區，同時設立陽性對照（無藥孔區）和陰性對照（無菌孔區），35℃孵育72 h。每孔加入100μl XTT/甲萘醌混合溶液，孵育4 h，每孔取80μl上清液，轉移到另1個96孔板，并在490 nm處讀取A值［9］。所有實驗均重復3次。藥物聯合效應根據分數抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）評判，FICI=SMICA聯合/SMICA單獨+SMICB聯合/SMIC B單獨［9］。FICl＜ 0.5為協同作用，0.5＜FICI≤4為無關，FICI＞4為拮抗作用［10］。

二、結果

1.抗真菌藥單用抗皮炎外瓶霉生物膜效應：伊曲康唑、伏立康唑和卡泊芬凈對皮炎外瓶霉生物膜的SMIC50和SMIC80范圍均＞32mg/L；兩性霉素B的SMIC50為1～2mg/L，SMIC80為4～8mg/L。見表1。

2.抗真菌藥聯合抗皮炎外瓶霉生物膜效應：伏立康唑與兩性霉素B聯合時，兩者SMIC80范圍分別降低至0.5～1mg/L和0.25～0.5mg/L，表現為協同效應。兩性霉素B與伊曲康唑、兩性霉素B與卡泊芬凈、伏立康唑與卡泊芬凈聯合時均未觀察到協同效應。所有聯合用藥組均未觀察到拮抗作用。見表1。

三、討論

我們用改良的96孔板法構建皮炎外瓶霉生物膜體外模型，進行抗真菌藥物敏感性測試。由于皮炎外瓶霉生長緩慢，在制備過程中，我們將菌懸液調至1×107/ml，孵育時間延長到72 h；生物膜藥物敏感性測試的孵育時間與參考方案相比也延長至48 h［5-6，8］。研究顯示，抗真菌藥物單藥作用于皮炎外瓶霉生物膜時，兩性霉素B的SMIC50濃度范圍為1～2mg/L，相對其他藥物具有較好的抗皮炎外瓶霉生物膜活性。既往研究顯示，伏立康唑、伊曲康唑和兩性霉素B對皮炎外瓶霉游離態均有較好的抗真菌效應［4］，但本研究發現，伏立康唑、伊曲康唑和卡泊芬凈對皮炎外瓶霉生物膜的SMIC50及SMIC80范圍均較高，證實抗真菌藥物對生物膜態的活性明顯低于對游離態的活性［11］。體外聯合藥物敏感試驗顯示，兩性霉素B與伏立康唑聯合對皮炎外瓶霉生物膜具有協同效應，既往有此聯合方案成功治愈系統性皮炎外瓶霉感染的報道［12］。此外，既往研究顯示，卡泊芬凈與兩性霉素B或伏立康唑聯合分別對62.5%和93.8%的游離態皮炎外瓶霉具有協同效應［7］，但本研究發現，這兩個組合方案以及兩性霉素B與伊曲康唑組合對皮炎外瓶霉生物膜均無協同作用，體現了生物膜態和游離態對聯合藥物敏感性的差異，提示我們應積極探索針對生物膜的新型治療方案。

綜上所述，與伏立康唑、伊曲康唑和卡泊芬凈相比，兩性霉素B具有更強的抗皮炎外瓶霉生物膜作用，兩性霉素B和伏立康唑聯合能夠增強抗皮炎外瓶霉生物膜的作用，為難治性皮炎外瓶霉相關感染的治療方案提供理論基礎。本研究為體外實驗，將來還需要更多研究來證實該聯合方案的體內效應。

表1 4種抗真菌藥單用及聯合體外抗皮炎外瓶霉生物膜50%與80%最低抑菌濃度（SMIC50、SMIC80） mg/L

志謝北京大學第一醫院李若瑜教授和劉偉教授提供皮炎外瓶霉臨床菌株

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