鹽裂皮膚間接免疫熒光及BP180 NC16a酶聯免疫吸附測定在大皰性類天皰瘡診斷中的意義

李鎖 李志量 荊可 向睿宇 張寒梅 馮素英

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院皮膚科 江蘇省皮膚病與性病學重點實驗室

大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）是一種自身免疫性表皮下水皰病［1］。BP典型皮損為正常皮膚或紅斑及風團基礎上出現張力性水皰、大皰，體表任何部位均可受累，但常見于軀干和四肢，常伴瘙癢，有時有燒灼感，尼氏征通常陰性，黏膜受累不常見［2］。BP患者血清中產生針對皮膚基底膜帶的循環自身抗體，靶抗原為BP抗原1（BPAg1，又稱BP230，相對分子質量為230 000）和BP抗原2（BPAg2，又稱BP180，相對分子質量為180 000），它們是位于半橋粒上的兩個主要結構蛋白。目前研究認為，BP180在BP發病上起主要作用，其NC16a表位與BP病情活動度和嚴重程度相關［3］。BP病理變化為表皮下水皰，直接免疫熒光顯示基底膜帶有IgG和（或）C3沉積，行鹽裂皮膚間接免疫熒光檢查（indirect immunofluorescence on salt-split skin，IIFSSS）可發現免疫復合物沉積在表皮側［4］。BP的診斷基于臨床表現、病理和免疫學檢測結果，目前少有對中國人群BP采用血清學診斷方法的大樣本臨床研究。基于此，我們分析IIF-SSS及BP180 NC16a酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測在BP診斷中的敏感性、特異性、相關性，從而更好地指導血清學診斷方法在BP的應用。

對象與方法

一、臨床資料

2015年1月至2017年8月，中國醫學科學院皮膚病醫院初診為BP患者174例，所有入選病例符合以下標準：①典型臨床以皮膚紅斑基礎上緊張性水皰為主要表現，尼氏征陰性；②組織病理證實為表皮下水皰，真皮內有嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤；③患者正常皮膚DIF示基底膜帶有IgG和（或）C3沉積；④IIF-SSS檢查示免疫復合物［IgG和（或）C3］線狀沉積在表皮側；⑤行BP180抗體檢測陽性（即＞9 U/ml）；其中BP診斷符合④⑤；或者符合①②③+［④或⑤］［4-6］。174例中男108例，女66例，年齡2～95歲，平均70.25歲，均在病情活動期抽取全血。對照組129例中男76例，女53例，年齡5～90歲，平均53.12歲；對照組中健康體檢30例，天皰瘡38例，濕疹21例，膿皰性銀屑病7例，多形紅斑7例，扁平苔蘚4例，藥疹4例，丘疹性蕁麻疹5例，癢疹3例，單純性大皰性表皮松解癥4例，獲得性大皰性表皮松解癥2例，P200類天皰瘡1例，紅皮病2例，增殖性膿皮病1例。本研究通過中國醫學科學院皮膚病醫院醫學倫理委員會批準，入選者均簽署知情同意書。

二、方法

1.IIF-SSS：取包皮切除術后新鮮正常人包皮皮膚，去除皮下脂肪，切成0.5 cm×0.5 cm，放入預冷的1 mol/L NaCl溶液中，4℃，連續、緩慢、勻速攪拌24～48 h，每24小時換液1次，至表皮微微皺起，OCT包埋，切成6 μm厚冰凍切片，制成底片，-80℃保存。制好的鹽裂皮膚冰凍切片取出，PBS清洗5 min 2次，并用去離子水漂洗1次。用PBS 1∶10稀釋受檢血清，滴加30 μl稀釋的血清至底片上，37℃濕盒內孵育切片30 min，PBS清洗5 min 3次，雙蒸水漂洗1次，吹干后加入以1∶50稀釋異硫氰酸熒光素標記羊抗人IgG及C3（FITC-IgG及C3購于北京中杉金橋生物技術有限公司），重復上述孵育、清洗、漂洗步驟，吹干后熒光顯微鏡（日本Nikon公司）下觀察結果。以鹽裂皮膚表皮側或真皮側見熒光沉積判斷為陽性（圖1）。

2.BP180 NC16a-ELISA和定量方法：嚴格按照BP180 NC16a-ELISA抗體檢測試劑盒（日本MBL公司）說明書操作。將待測血清（1∶101稀釋）及Calibrator 1和Calibrator 2各100 μl分別加入至抗原包被的微孔。室溫（20～25℃）孵育1 h，洗滌4次；各孔加入100 μl結合液，室溫孵育1 h，洗滌4次；各孔加入100 μl底物溶液，室溫孵育30 min；各孔加入100 μl終止液終止酶反應。酶標儀（美國BioTek公司）A450 nm下讀取每孔吸光度值，根據結果判定公式計算：Units（U/ml）=（A450＜Sample＞-A450＜Calibrator1＞）/（A450＜Calibrator2＞-A450＜Calibrator1＞）×100，每個樣品做2個復孔，取均值。結果判定：抗BP180NC16a-ELISA值（U/ml）＜9為陰性；＞9為陽性。

圖1 表皮下水皰病鹽裂皮膚間接免疫熒光檢測（箭頭）1A：裂隙表皮側可見熒光沉積；1B：裂隙表皮側和真皮側均可見熒光沉積；1C：裂隙真皮側可見熒光沉積；1D：裂隙表皮側和真皮側未見熒光沉積

3.統計學方法：用統計軟件SPSS 22進行分析。計量資料以±s表示，采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗法。計量資料用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）及ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）反映BP180 NC16a-ELISA法敏感性和特異性。用Spearman非參數雙變量相關分析方法分析IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA法相關性。

結果

一、IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA敏感性及特異性比較

174例BP患者及129例對照IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA結果見表1。BP患者及對照者BP180 NC16a-ELISA值及BP180 NC16a-ELISA ROC曲線見圖2。IIF-SSS敏感性為93.67%，特異性為100%，BP180 NC16a-ELISA的敏感性為96.55%，特異性為96.12%。BP180 NC16a-ELISA與IIF-SSF敏感性比較，P值0.214，差異無統計學意義。BP180 NC16a-ELISA與IIF-SSF特異性比較，P值為0.024，差異有統計學意義。BP180 NC16a-ELISA AUC值為0.978。

表1 大皰性類天皰瘡（BP）患者組與對照組鹽裂皮膚間接免疫熒光檢查（IIF-SSS）與BP180 NC16a酶聯免疫吸附測定（ELISA）結果比較

圖2 大皰性類天皰瘡（BP）患者組與對照組BP180 NC16a酶聯免疫吸附測定（ELISA）值及BP180 NC16a-ELISA ROC曲線

二、IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA相關性分析

IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA法相關系數為0.147，P＜0.05，差異有統計學意義。相關系數＞0.7是強相關，0.4～0.7是中度相關，0.1～0.3是弱相關。

三、直接免疫熒光（DIF）、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性

從174例BP患者選取25例具有典型BP臨床表現，尼氏征陰性，組織病理檢查證實為表皮下皰，真皮內有嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，并有DIF、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA檢測結果。結果顯示DIF敏感性為80%，IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性為96%，差異無統計學意義。

討論

BP好發于70～80歲老年人，＜50歲的人群很少患BP，偶見于兒童，隨著社會的老齡化及皰病血清學診斷的應用，BP患者人數呈上升趨勢［7］。不典型BP可模擬多形紅斑、出汗不良性濕疹、扁平苔蘚、藥疹、結節性癢疹、紅皮病等疾病，此外BP還需與表皮內水皰病以及其他表皮下水皰病鑒別，為臨床診斷帶來了挑戰［8］。研究認為，BP180在BP發病上起主要作用，BP180屬于Ⅱ型跨膜蛋白，N末端位于細胞內，C末端位于細胞外，其細胞外肽鏈含有15個膠原樣節段，故又稱為ⅩⅦ膠原（COL17），BP患者血清學研究及BP動物模型、冰凍切片模型和細胞模型的相關研究表明，COL17的NC16a結構域是BP主要的致病靶抗原，Hofmann等［3］和Zhao等［9］通過酶聯免疫吸附試驗發現NC16a自身抗體與BP病情活動度和嚴重程度相關。BP病理變化為表皮下水皰，直接免疫熒光顯示基底膜帶有IgG和（或）C3沉積。BP的傳統診斷基于臨床表現、病理和DIF檢測結果，基于此，我們對BP血清學診斷方法（IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA）進行相關分析并與DIF進行比較，從而更好地指導血清學診斷方法在BP的應用。

以往其他報道的IIF-SSS敏感性70%～85%，特異性96%～100%［10］，我們研究發現，IIF-SSS的敏感性為93.67%，特異性為100%，與之相比特異性一致，敏感性有所提高，說明IIF-SSS是BP診斷的重要標準。除BP以外，表皮側IgG和（或）C3沉積還可見于瘢痕性類天皰瘡，這種情況時靶抗原是表皮側抗原BP180NC16a表位和α6β4整合素。然而瘢痕性類天皰瘡靶抗原具有異質性，還包括真皮側抗原BP180羧基端表位、層粘連蛋白5和Ⅶ型膠原。瘢痕性類天皰瘡往往有多個抗原受累，因此多數IIFSSS為雙側沉積模式（IgG和/或C3同時沉積在表皮側和真皮側），有時還可表現為單獨真皮側沉積［11］。

BP180 NC16a-ELISA的敏感性為96.55%，特異性為96.12%，BP180 NC16a-ELISA的AUC值為0.978，說明BP180 NC16a-ELISA在BP診斷中具有較高價值。我們既往研究BP180 NC16a-ELISA特異性和敏感性均為97.62%［12］，與之相比，兩次研究結果一致。為了更好地探討血清學診斷方法在BP診斷中的價值，我們從174例BP患者選取25例具有典型BP臨床表現，尼氏征陰性，組織病理檢查證實為表皮下皰，真皮內有嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，并有DIF、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA檢測結果，結果顯示DIF敏感性為80%，IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性均為96%，BP血清學診斷方法（IIF-SSS，BP180NC16a-ELISA）的敏感性與DIF差異無統計學意義，說明血清學診斷方法和DIF均是BP診斷的重要方法。

IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA法相關性研究發現相關系數為0.147，P＜0.05，提示IIF-SSS與BP180 NC16a-ELISA法有相關性，但相關系數偏小。研究結果說明，IIF-SSS不僅與BP180自身抗體有關，可能還與BP230有關。既往研究發現，IIFSSS與BP180 NC16a-ELISA法無相關性，分析差異原因可能與IIF-SSS敏感性差異有關［1，12］。

BP血清學診斷方法特異性強、敏感性高，值得臨床推廣應用。BP血清學診斷我們推薦IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA法聯合使用，原因如下：①IIFSSS熒光結果可作為BP診斷的重要標準，并通過抗體沉積模式對表皮下水皰病進一步分類診斷；②BP180 NC16a-ELISA法不僅能夠為臨床提供客觀、定量、重復性好的數據，而且能夠為病情評估提供參數。

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