進展期非節段型白癜風患者外周血CD4+T細胞亞群分析

甄昱 李珊山

130021長春，吉林大學第一醫院皮膚科

研究顯示，白癜風是以功能性黑素細胞減少為主要特征的一種自身免疫性疾病，以T細胞為主的細胞免疫在白癜風發生發展中起重要作用［1］。其中CD8+T細胞對黑素細胞的損傷作用已獲得共識，而CD4+T細胞的改變則相對比較復雜，關于白癜風Th17以及Treg亞群的變化，目前尚存在爭議。為了解進展期NSV患者外周血中CD4+T細胞各個亞群的變化，我們對進展期非節段型白癜風（NSV）患者CD4+T細胞亞群特異性表面標志及其相關細胞因子進行了檢測，旨在探討白癜風發生早期外周血CD4+T細胞的免疫狀態，以期為臨床免疫抑制治療提供合理依據。

對象與方法

一、對象

進展期NSV組30例，男女各15例，年齡18～45歲，平均28.6歲；就診前2個月內均未接受糖皮質激素及免疫抑制劑等藥物治療。健康對照組（取自健康志愿者）30例，男女各15例，年齡17～43歲，平均26.1歲。本研究通過吉林大學第一醫院醫學倫理委員會批準，入選者均簽署知情同意書。

二、主要試劑和儀器

人Ficoll淋巴細胞分離液購于美國Sigma-Aldrich公司。淋巴細胞活化試劑盒、FACS calibur流式細胞儀購于美國BD公司。細胞內染色試劑盒、抗人CD4-FITC單抗、抗人干擾素（IFN）-γ-PECy5單抗、抗人IL-4-PE單抗、抗人IL-17A-APC單抗、抗人CD25-PE單抗及抗人CD127-APC單抗、人IFN-γ、IL-4、IL-17A、轉化生長因子（TGF）β1均購于美國eBiboscience公司。酶標儀購于美國Bio-Rad公司。

三、方法

1.樣本采集：NSV患者及健康對照外周血各5m l，經抗凝處理后，Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個核細胞（PBMC）；5 ml外周血不經抗凝處理，按常規方法收集血清后，分裝入1.5ml微量離心管內，-80℃冰箱保存備用。

2.細胞表面染色：2×106PBMC（4× 105/管）加入CD4，CD25，CD127流式熒光抗體進行表面染色，4℃孵育 30 min，用0.1%BSA PBS離心洗滌后，FACS Calibur流式細胞儀檢測和Flowjo軟件分析。

3.淋巴細胞體外活化培養：5×106PBMC用含10%FBS的RPMI1640培養液重懸，計數后，調整細胞濃度，4×105/孔加入96孔板內培養，同時在孔內加入稀釋后的淋巴細胞活化試劑，于37℃、5%CO2培養箱內培養6 h，收集細胞，進行細胞表面CD4染色。

4.細胞因子染色：將已完成表面分子染色的細胞用0.1%BSA PBS離心洗滌后，每管加入300μl eBioscience的細胞內染色試劑盒內固定破膜打孔液處理細胞，室溫作用30min，破膜打孔液離心洗滌1次，然后用打孔液稀釋的細胞因子抗體進行細胞內染色，室溫孵育30min，用破膜打孔液離心洗滌2次。FACSCalibur流式細胞儀檢測和Flowjo軟件分析。

5.ELISA檢測血清中細胞因子水平：按照ELISA檢測試劑盒說明書，在ELISA板中加入相關細胞因子的包被抗體，4℃過夜。然后用洗液洗板，加入包被液室溫孵育1 h，封閉非特異性抗原。再次洗板后，加入倍比稀釋后的標準品以及待檢測血清樣本，室溫孵育2 h，再次洗板后，加入捕獲抗體，室溫作用1 h，洗板，加入顯色底物，室溫作用30min，加入終止液終止反應。酶標儀讀板。

四、統計學方法

實驗數據應用Graphpad Prism 5.0軟件進行數據處理。CD4+T細胞各亞群的比例、Th1/Treg、Th2/Treg及Th17/Treg比例和分泌的細胞因子水平均用±s表示，各組數據比較采用單因素方差分析以及StudentNewman Keuls檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、外周血CD4+T細胞亞群的分布

圖1 流式細胞儀檢測進展期非節段型白癜風組（NSV）與健康對照組外周血中CD4+T細胞亞群比例 Th1，Th2及Th17在單個核細胞體外活化后染色，Treg是單個核細胞直接染色

如圖1和表1所示，進展期NSV組外周血Th1細胞與Th17細胞的比例均顯著高于健康對照組，差異有統計學意義，而Th2和Treg的比例則與健康對照組之間比較，差異無統計學意義。與健康對照相比，Th1/Treg與Th17/Treg的比例顯著增高，而Th2/Treg的比例則未發生顯著變化，見表2。

二、ELISA檢測血清中細胞因子水平

在進展期NSV組血清中，只有IL-17A的水平顯著高于健康對照。雖然IFN-γ的含量高于健康對照，但二者比較，差異無統計學意義。IL-4和TGF-β1的水平與健康對照比較，差異無統計學意義。見表3。

討 論

本研究闡述了NSV患者進展期階段外周循環中Th1，Th2，Th17和Treg CD4+T細胞亞群的改變。我們發現，在NSV處于進展期時，Th1和Th17細胞反應在外周血CD4+T細胞中占主導地位，而Th2與Treg則未發生顯著性變化。Th1/Treg與Th17/Treg比例失衡，提示外周循環中效應性T細胞與抑制性T細胞免疫平衡已被打亂，說明機體對黑素細胞自身抗原已失去耐受。

每個CD4+T細胞亞群均可分泌其相應的細胞因子，如Th1細胞分泌IFN-γ，Th2細胞分泌IL-4，Th17細胞分泌IL-17A及Treg分泌TGF-β1。除Treg外，流式細胞檢測也是根據這些特異的細胞因子來界定這些細胞亞群：CD4+IFN-γ+Th1，CD4+IL-4+Th2，CD4+IL-17A+Th17。體外實驗揭示，上述這4種細胞因子均可在體外影響黑素細胞的正常功能甚至可以影響黑素細胞的存活。據報道，IFN-γ和IL-17A體外都能刺激黑素細胞產生IL-6，進而抑制黑素的產生；IL-4則可直接影響黑素細胞的黑素生成［2］。IFN-γ［3］和 TGF-β1 體外可誘導黑素細胞凋亡［4］，TGF-β1還可以抑制黑素細胞生長。由此推測，這些相應的細胞亞群可能在白癜風的發病過程中發揮作用。

表1 進展期非節段型白癜風（NSV）組與健康對照組外周血中CD4+T細胞亞群分布比較（%±s）

表1 進展期非節段型白癜風（NSV）組與健康對照組外周血中CD4+T細胞亞群分布比較（%±s）

注：n=30。a與健康對照組相比，P＜0.05

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表2 進展期非節段型白癜風（NSV）組與健康對照組外周血Th1/Treg，Th2/Treg，Th17/Treg比較（±s）

表2 進展期非節段型白癜風（NSV）組與健康對照組外周血Th1/Treg，Th2/Treg，Th17/Treg比較（±s）

注：n=30。與健康對照組比較，a P＜0.01；b P＜0.05

組別健康對照組進展期NSV組Th1/Treg 1.32±1.17 2.37±1.42a Th2/Treg 0.31±0.16 0.32±0.13 Th17/Treg 0.29±0.12 0.41±0.21b

表3 進展期非節段型白癜風（NSV）組與健康對照組血清中細胞因子分泌水平比較（±s） ng/L

表3 進展期非節段型白癜風（NSV）組與健康對照組血清中細胞因子分泌水平比較（±s） ng/L

注：n=30。a與健康對照組比較，P＜0.001。IFN：干擾素；IL：白細胞介素；TGF：轉化生長因子

組別健康對照組進展期NSV組IFN-γ（Th1）29.56±14.76 34.95±14.94 IL-4（Th2）0.2868±0.07 0.2911±0.11 IL-17A（Th17）8.66±1.83 23.08±5.80a TGF-β1（Treg）1321±140.8 1121±181.7

本文結果顯示，外周血CD4+T細胞中僅Th1和Th17細胞發生了顯著變化。有文獻報道，在白癜風皮損及外周血PBMC中均發現IFN-γmRNA表達顯著增高［3］，提示機體白癜風自身免疫傾向于Th1反應。我們發現，進展期NSV患者外周血中CD4+IFN-γ+Th1細胞比例顯著高于健康對照，這一結果不僅排除了同樣表達IFN-γmRNA的CD8+T細胞的干擾，而且在蛋白水平上證實了Th1細胞在外周血中的改變。此外，該發現還與在白癜風皮損及皮損周邊處發現有分泌IFN-γ的CD4+T細胞［2］的報道相呼應。盡管我們發現外周血中Th1細胞比例增高，但是血清中IFN-γ水平雖略高于健康對照，差異卻無統計學意義。這一結果與Singh等［5］不同，他們發現IFN-γ水平顯著低于健康對照。IFN-γ雖然主要由Th1細胞分泌，但CD8+T細胞也可以分泌IFN-γ。而我們發現，外周循環中CD8+T細胞并沒有發生顯著性變化（結果未顯示），血清中IFN-γ的總體水平可能是受到CD8+T細胞的影響。因此，僅根據血清中IFN-γ含量及其mRNA表達水平，并不能準確判定外周血中Th1細胞的變化；而細胞因子染色檢測的結果更能直接體現Th1細胞在CD4+T細胞中所占的比例改變。

Th17細胞是有別于Th1和Th2的另一個效應性CD4+T細胞亞群，通過分泌IL-17A在多種自身免疫性疾病中發揮作用。隨著其在自身免疫性疾病中的作用被認可，人們發現，Th17細胞也參與了白癜風的自身免疫，在白癜風皮損及血清中都發現IL-17表達增高［6-7］。我們的結果顯示，進展期NSV患者Th17在外周血CD4+T細胞中比例顯著高于健康對照，同時血清中其特異性分泌的細胞因子IL-17A水平也顯著高于健康對照。這與Wang等［6］發現Th17細胞在白癜風皮損周邊的浸潤是相符合的。血清中IL-17A表達增高也與報道一致［7-8］。我們的數據再次證實，Th17細胞參與了白癜風早期發病。

有研究發現，白癜風患者外周血IL-4mRNA表達及血清IL-4水平均顯著高于健康對照［9］。也有研究發現，白癜風患者血清IL-4和外周血中Th2細胞特異性轉錄因子GATA3mRNA表達顯著低于正常［10］。有研究報道，白癜風患者血清中IL-4水平很低，無法檢測。為了明確白癜風外周血中Th2細胞的變化，我們對Th2細胞及其特異性的細胞因子IL-4與健康對照進行了比較。我們認為，在進展期NSV患者外周血中，Th2細胞比例與健康對照之間沒有差異。而與外周血中的比例變化相對應的是，患者血清中IL-4含量亦沒有發生顯著變化。

作為機體內免疫抑制細胞，Treg在白癜風自身免疫研究中得到廣泛關注。一些研究發現，其在白癜風皮損內數量減少［11］，而另一個研究組發現白癜風皮損內其特異性轉錄因子Foxp3表達增多，但Treg免疫抑制功能降低［12］。還有報道發現，外周血Treg比例顯著降低并伴有FOXP3mRNA低表達［13］，或伴有血清TGF-β1低表達［14］。本研究顯示，在進展期NSV患者外周血中，Treg的比例及其標志性的細胞因子TGF-β1與健康對照均無顯著差異。我們的結果與其他實驗室報道的外周血中Treg比例報道存在不一致的情況，可能與各個實驗室選取的Treg定義標準略有不同有關。他們是以CD4+CD25+/CD4+Foxp3+作為Treg的界定標準，可是活化后的人CD4+T細胞CD25/Foxp3的表達比例及表達量均會增加，這個標準略有不足；而我們是以CD4+CD25+CD127-作為Treg的標準，似更為嚴格。我們檢測發現，血清中IL-4和TGF-β1含量沒有顯著性改變，與流式細胞儀檢測外周循環中Th2和Treg的比例結果相一致。這些結果進一步支持進展期NSV患者外周血中Th1和Th17的主導作用。

總之，本研究發現，在進展期NSV外周血中，存在Th1/Treg及Th17/Treg細胞比例顯著增高，并伴隨促炎性細胞因子IL-17A表達水平顯著增高，提示效應性CD4+T細胞與抑制性CD4+T細胞之間平衡被打破，機體處于免疫活化狀態。Th1和Th17這兩種效應性CD4+T細胞，發生了顯著變化，推測它們在白癜風發病早期的自身免疫中發揮了重要的作用。而針對它們分泌的特異性的細胞因子進行拮抗阻斷，可能是潛在的抑制白癜風自身免疫進展的手段之一。

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