天皰瘡患者皮損局部異位淋巴結構的病理學特征

周生儒 鄒雅茹 劉芝翠 趙肖慶 鄭捷 潘萌

200025上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科

天皰瘡是一種自身免疫性大皰性皮膚病，主要分為尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）和落葉型天皰瘡（pemphigus foliaceus，PF），而增殖型天皰瘡和紅斑型天皰瘡則分別為它們的亞型。目前公認的天皰瘡發病機制為患者外周血中存在針對角質形成細胞細胞間橋粒結構中的橋粒黏蛋白3（desmoglein 3，Dsg3）和（或）橋粒黏蛋白 1（desmoglein 1，Dsg1）的自身抗體，抗原抗體結合，導致細胞間黏附喪失，出現典型的臨床和病理表現［1］。雖然，外周血的抗體循環分布于全身，但患者的皮損并非均勻分布于全身，這提示，可能存在另外的局部免疫機制使得頭面部、軀干等脂溢部位成為天皰瘡皮損的好發部位。研究證實，真皮內免疫細胞在慢性炎癥性皮膚病中起了重要作用［2-3］。因此，天皰瘡皮損處是否普遍存在淋巴細胞浸潤，浸潤的淋巴細胞的類型是什么，浸潤淋巴細胞與疾病的發病和維持是否相關，是我們研究的重點。我們對上海瑞金醫院皮膚科93例PV和PF患者組織病理切片中真皮內淋巴細胞的浸潤分布進行了研究，并用免疫組化的方法研究浸潤淋巴細胞的類型，分析浸潤淋巴細胞與患者外周血抗體滴度的相關性。

資料與方法

一、資料

1.標本來源：天皰瘡活檢標本及外周血均來源于2014年1月至2016年12月就診于上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科的PV患者56例，PF患者37例。病理取材為新鮮皮損，PV患者主要為水皰，PF患者主要為糜爛面或結痂面。所有患者均根據臨床表現、組織病理、直接免疫熒光等明確診斷。用于免疫組化正常對照的皮膚組織來自皮膚科門診手術室志愿者。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器：兔抗人CD3多克隆抗體、鼠抗人CD20單抗、鼠抗人CD138單抗、購自丹麥Dako公司；DAB免疫組化試劑盒購自福州邁新生物開發有限公司；抗人Dsg1、Dsg3抗體ELISA試劑盒購自日本MBL公司；iMark酶標儀購自美國Bio-Rad公司；光學顯微鏡購自德國Zeiss公司。

二、方法

1.天皰瘡皮損處淋巴細胞聚集程度評定：收集93例皮膚活檢標本經4%甲醛固定，常規切片后HE染色。皮損浸潤淋巴細胞統計，參照改良的淋巴細胞聚集程度的等級評定系統進行評定。Grade1定義為徑向細胞計數2～5層，Grade2定義為徑向細胞計數6～10層，Grade3定義為徑向細胞計數 ≥ 11層［4］。若細胞彌散分布，則人為劃定邊界。若淋巴細胞以橢圓形聚集則取最大最小徑向細胞計數的均值。

2.天皰瘡皮損處淋巴細胞免疫組化染色：從93例標本中選擇8例PV和8例PF樣本進行免疫組化染色。考慮受到免疫組化染色敏感性的限制，為保證有足夠多的淋巴細胞，在含有Grade2或Grade3淋巴細胞聚集的樣本中進行隨機選擇。分析患者皮損組織中CD3+T細胞、CD20+B細胞、CD138+漿細胞表達及其分布情況。免疫組化步驟均按照試劑說明書進行，所有染色均設陽性對照（扁桃體）和陰性對照（正常皮膚）。免疫組化染色結果判定：CD3、CD20及CD138表達陽性者均為棕色顆粒，CD3表達定位于細胞膜和（或）胞質，CD20、CD138表達定位于細胞膜。光學顯微鏡（×200）下觀察每個淋巴細胞聚集處是否有表達陽性的細胞。

3.ELISA法檢測患者血清中特異性自身抗體：用抗Dsg1和Dsg3抗體檢測試劑盒，按產品說明書操作，iMark酶標儀在450 nm波長下讀取吸光度。

4.統計學方法：用Graphpad 5.0統計軟件進行統計分析，淋巴細胞密集程度指數與抗體滴度的相關性采用Spearman相關分析方法計算P值。用非參數Mann-WhitneyU檢驗比較兩組間差異，數據以±sx表示。

結 果

一、天皰瘡患者皮損局部淋巴細胞聚集程度判定

對2014年1月至2016年12月就診于上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科的PV患者56例，PF患者37例的HE切片進行分析。患者的性別、年齡等臨床資料見表1。天皰瘡局部皮損淋巴細胞聚集評級的示例見圖1。統計數據表明，93例病理切片中，93例（100.00%）病理切片有Grade 1淋巴細胞聚集出現，64例（68.09%）病理切片有Grade 2淋巴細胞聚集出現，10例（10.06%）病理切片有Grade 3淋巴細胞聚集出現。PF和PV具有相似的概率，見表2。

93例患者病理切片（×50）鏡頭下Grade1、Grade2、Grade3淋巴細胞聚集的個數。每個Grade1淋巴細胞聚集大約有50個淋巴細胞，Grade2大約有200個淋巴細胞，Grade3大約有600個淋巴細胞［5］。然后以此計算每例病理切片下淋巴細胞總數，定義為淋巴細胞密集程度指數。淋巴細胞的密集程度指數在PF（925.24± 127.91，n=37）和PV（1 008.77±141.75，n=56）差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 93例天皰瘡患者臨床資料

二、PF和PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗體滴度

用ELISA的方法檢測36例PF患者和55例PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗體滴度，并進行統計分析，結果見表3。

三、淋巴細胞密集程度指數與抗體滴度的相關性分析

分析PF患者外周血抗Dsg1抗體滴度、PV患者外周血抗Dsg1抗體滴度、PV患者外周血抗Dsg3抗體滴度與淋巴細胞密集程度指數的相關性。數據統計分析結果表明，淋巴細胞聚集程度與抗體滴度間無相關關系（圖2）。

四、浸潤淋巴細胞的類型

通過免疫組化分析，在16例中，全部有CD3+T細胞出現，15例有CD20+B細胞，12例有CD138+漿細胞。在PV患者中，7例有CD20+B細胞出現，6例有CD138+漿細胞出現。在PF患者中，8例有CD20+B細胞出現，6例有CD138+漿細胞出現。圖3示1例天皰瘡患者皮損處CD3+T細胞、CD20+B細胞、CD138+漿細胞聚集。我們觀察鏡下Grade 1～3淋巴細胞聚集中是否有CD3+T細胞、CD20+B細胞、CD138+漿細胞出現。發現在Grade 1～3淋巴細胞聚集區域中均含有大量CD3+T細胞，而含有CD20+B細胞的聚集占總數52.80%±5.78%，含有CD138+漿細胞的聚集占總數34.59%±7.42%。CD3+T細胞、CD20+B細胞、CD138+漿細胞在PV和PF的分布差異無統計學意義。

表2 93例天皰瘡患者淋巴細胞聚集的病理評級［例（%）］

表3 PF和PV患者外周血抗Dsg1/Dsg3抗體滴度

圖1 天皰瘡皮損處淋巴細胞聚集程度評級示例 1A：Grade1（HE×400，方框）；1B：Grade 2（HE×400，方框）；1C：代表性Grade3（HE×200，方框）

圖2 淋巴細胞密集程度指數與抗體滴度相關性 2A：PF患者淋巴細胞密集程度指數與外周血抗Dsg1抗體滴度無相關性；2B：PV患者淋巴細胞密集程度指數和與外周血抗Dsg1抗體滴度無相關性；2C：PV患者淋巴細胞密集程度指數與外周血抗Dsg3抗體滴度無相關性

圖3 天皰瘡皮損處浸潤淋巴細胞示例（HE×200） 3A：天皰瘡皮損處有大量CD3+T細胞；3B：天皰瘡皮損處有CD20+B細胞；3C：天皰瘡皮損處有CD138+漿細胞；3D：正常對照真皮內有少量CD3+T細胞；3E：正常對照真皮內無CD20+B細胞；3F：正常對照真皮內無CD138+漿細胞

討 論

天皰瘡患者血清中存在抗角質形成細胞橋粒結構的Dsg1、Dsg3抗體，該抗體在引發角質形成細胞間粘附的喪失和水皰形成中起到主要的致病作用。雖然外周血中抗體可以均勻分布于全身皮膚，但是天皰瘡皮損并不累及全部皮膚。皮膚是一個重要的免疫器官，也是天皰瘡自身免疫的靶器官。皮膚局部免疫細胞的改變與多種皮膚病的發病息息相關。例如，白癜風皮損局部CD8+T細胞與其發病相關［6］，特應性皮炎皮損處CD20+B細胞大量聚集［7］等。天皰瘡皮損局部是否也可能存在可以誘發和加重皮損的免疫性機制尚待研究。

我們對瑞金醫院皮膚科93例PV和PF患者的病理切片進行了回顧性分析，發現真皮層異位淋巴細胞的浸潤具有普遍性，而且在PV和PF之間無顯著差別。這說明天皰瘡皮損處普遍存在異位淋巴結構。同時我們選擇了8例PV患者和8例PF患者進行免疫組化染色，發現在16例樣本中，全部有CD3+T細胞出現，15例有CD20+B細胞，12例有CD138+漿細胞。說明T淋巴細胞和B淋巴細胞共同存在于天皰瘡皮損處，部分皮損區域存在漿細胞，而漿細胞與IgG共染是陽性的（數據未列出）。因此在天皰瘡皮損局部，T細胞有可能促進B細胞分化成漿細胞，漿細胞產生致病性特異性抗體，需要進一步研究。

天皰瘡是一種自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的靶器官普遍存在異位淋巴結構（ectopic lymphoid like，ELS）［8］。ELS是一種在自身免疫靶器官、感染局部、腫瘤局部形成，而抗原清除后可消失的瞬態結構。ELS的結構具有異質性，它可以類似典型的次級淋巴器官（如淋巴結、扁桃體）即具有生發中心、分離的B細胞及T細胞區、濾泡狀樹突細胞及典型的高內皮小靜脈等特征性結構；也可僅表現為T、B淋巴細胞在局部呈團塊狀的浸潤［9-10］。在類風濕性關節炎的關節滑膜、干燥綜合征的唾液腺和淚腺、多發性硬化的中樞神經系統、系統型紅斑狼瘡的腎臟等自身免疫性疾病的靶器官均存在ELS［8］。這些部位的ELS主要以T、B細胞浸潤的形式存在，只有極少的部位存在典型的生發中心結構［11-13］。天皰瘡局部的淋巴細胞浸潤也是以T、B淋巴細胞成團浸潤為主，沒有發現類似二級淋巴器官的T、B細胞分區及生發中心結構，部分區域高內皮小靜脈染色陽性（數據未列出）。這些特征與其他自身免疫性疾病靶器官的ELS特征較為一致，因此我們認為天皰瘡局部的淋巴細胞浸潤也是ELS。

目前研究認為,ELS在抗感染免疫和腫瘤免疫中具有保護作用，而在自身免疫和移植免疫中具有致病作用［8］。研究證實在類風濕關節炎的關節滑膜的ELS中，外周輔助型T細胞能夠輔助局部B細胞產生抗原特異性抗體，從而可能對于疾病的發生發展有重要作用［14-17］。天皰瘡皮損處ELS中是否存在Dsg抗原特異性T細胞輔助抗原特異性B細胞分化為漿細胞，并進一步分泌抗dsg1和（或）dsg3抗體，進而產生免疫病理作用，需要進一步研究。目前我們的研究沒有發現天皰瘡局部的異位淋巴細胞的浸潤程度與外周血抗體滴度具有相關性。這可能是因為切片部位的真皮淋巴細胞密度不能反映出全身皮膚浸潤淋巴細胞的程度以及所有皮損的嚴重程度。進一步對天皰瘡皮損處淋巴細胞致病功能的研究可能需要移植皮損至重癥聯合免疫缺陷小鼠，觀察特異性抗體產生及淋巴細胞的存活與增殖。

綜上所述，本文主要闡明了天皰瘡患者皮損普遍存在大量淋巴細胞浸潤，T、B細胞共存并呈團塊狀浸潤，部分皮損處存在CD138+漿細胞，可能形成ELS，參與皮損的發生、發展和加重。ELS的具體構成模式及其功能尚待進一步闡明。

志謝上海交通大學醫學院免疫所王宏林教授課題組

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