慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞中STING基因表達與HBV DNA載量的關系

楊曉燕，張平安，牛志立，王方平

(武漢大學人民醫院，湖北 武漢 430060)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是嚴重危害人類健康的重大肝臟疾病之一[1]。根據世界衛生組織統計報道，全球約有二十多億人感染過乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，有3.6億人患CHB，每年有60萬人因HBV相關性肝衰竭、肝硬化或肝細胞癌死亡[2]。目前，乙型肝炎的臨床治療以干擾素和核酸類及核酸類似物等藥物為主，但治療效果并不理想[3]。HBV是一種沒有明顯細胞毒性的嗜肝性雙鏈DNA病毒，可導致急性和慢性肝炎[4]。通常認為，細胞免疫應答的活力和強度可以決定HBV感染是否是被清除或是持續[5]。然而，除了適應性免疫，由通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原體相關分析模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)誘導的先天免疫反應在控制病毒感染中也發揮不可或缺的作用[6]。近年研究[7-9]表明，干擾素刺激基因(stimulator of interferon genes，STING)是天然免疫信號通路中一種重要的中間蛋白，它不僅參與幾乎所有胞內PRRs誘導dsDNA產生I型干擾素(interferon，IFN)的過程，其自身也可以作為PRRs識別c-di-GMP，c-di-AMP并誘導產生IFN。藉此，為探討STING在機體抗HBV免疫應答中的作用機制，我們觀察了CHB患者外周血單個核細胞SITNG的表達,以及HBV DNA復制情況，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2016年2月—2017年2月在武漢大學人民醫院感染科初入院的CHB患者88例為CHB 組，其中男性42例，女性46例；年齡18～83歲，平均(54±15)歲；CHB的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[10]，所有患者在入院前6個月內未經過任何抗病毒治療，排除其他嗜肝病毒感染，自身免疫系統疾病，其他系統嚴重疾病及感染性疾病。選取同期來我院進行體檢的健康人群，共74例為對照組，其中男性35例，女性39例；年齡20～85歲，平均(56±15)歲。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol和SYBR Premix Ex Taq II購自TaKaRa公司，反轉錄試劑盒Thermo Scientific購自公司。RNA濃度測定采用Thermo Scientific公司的分光光度計NanoDrop 2000。PCR分析儀由Applied Biosystem Inc公司生產，熒光定量PCR儀LighterCycler1.2 由羅氏生產。HBV DNA 病毒載量檢測試劑購自凱杰生物工程有限公司，檢測儀器為羅氏 LC480，實驗過程嚴格按試劑說明書進行操作；HBV-DNA 定量最低檢出限為5×102IU/mL，定量檢測線性范圍為1×103～1×107IU/mL。

1.3 研究方法

1.3.1 引物設計 利用美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)網站中提供的STING mRNA序列和BLAST進行引物設計，見表1。所有引物均由上海維基生物科技有限公司合成。PCR擴增產物的溶解曲線峰單一，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示目的條帶單一并且目的基因片段的長度與預期設計的長度一致，表明引物的特異性較好。見圖1～2。

表1 STING、干擾素基因及GAPDH基因的上下游引物

圖1 STING、干擾素基因及GAPDH基因引物溶解曲線

注：M為標準分子量

圖2STING、干擾素基因及GAPDH基因PCR產物凝膠電泳圖

Figure2Gel electrophoresis map of PCR products ofSTING, interferon genes, andGAPDHgene

1.3.2 mRNA提取和逆轉錄 采集所有研究對象空腹靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，嚴格按照淋巴細胞分離液說明書分離外周血單個核細胞。單個核細胞總mRNA的提取采用Trizol法，所獲得RNA 的純度要求為A260 nm/A280 nm>1.8。進行逆轉錄時，取11 μL RNA模板并加入1 μL oligo引物混勻后瞬時離心，65℃加熱5 min，冰上加入逆轉錄反應體系：4 μL Reaction Buffer，2 μL Mix，1 μL RI，1 μL RT。反應條件為：42℃ 60 min，72℃ 10 min，4℃保存。得到的cDNA產物置于-20℃保存備用。

1.3.3 熒光定量PCR檢測 反應體系為1 μL cDNA，各l μL上下游引物，10 μL SYBR Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX II，7.6 μL ddH2O，總體積為20 μL。擴增反應條件為5個基因(STING、IFN-α、IFN-β、GAPDH、內參基因)的反應條件均為預變性94℃ 30 s，變性94℃ 20 s，退火60℃ 20 s，延伸72℃ 35 s，PCR進行50個循環，溶解曲線條件為：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。對CHC組和健康組4個目的基因mRNA的表達采用相對表達量ΔCT進行比較，ΔCt=Ct目的-Ct內參[11]。擴增效率驗證：本實驗對4個基因(STING、IFN-α、IFN-β、GAPDH)進行了10倍稀釋，稀釋5個梯度，目的基因和內參基因擴增效率相差小于5%，且在98%～102%之間，可以認為擴增效率近似相等[12]。STING、干擾素基因及GAPDH基因實時熒光定量PCR的擴增曲線見圖3。

圖3STING、干擾素基因及GAPDH基因熒光定量PCR擴增曲線

Figure3Real-time fluorescence quantitative PCR amplification curves ofSTING, interferon genes, andGAPDHgene

2 結果

2.1 一般資料 CHB組與對照組兩組研究對象在性別構成比和年齡間的比較差異無統計學意義(t=0.027，P>0.05)，而在肝功能指標天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)比較，差異有統計學意義(t值分別為52.530、49.430，均P<0.01)，見表2。

表2CHB組與對照組一般資料比較

Table2Comparison of general data between CHB group and control group

組別例數性別[男，n(%)]年齡(歲，x±s)AST(mmol/L，x±s)ALT(mmol/L，x±s)CHB組8842(47．72)53．50±14．7950．01±35．1057．13±39．84對照組7435(47．30)55．61±14．8818．35±7．2822．57±4．77t/χ2-0．003-0．90151．53049．430P-0．9560．6840．0010．001

2.2 CHB組和對照組STING及干擾素基因mRNA表達量的比較 與健康對照組相比，CHB組患者STING、IFN-α、IFN-β表達量均上調，分別是健康對照組的2.95、3.14、2.01倍，差異有統計學意義。見表3。

組別例數基因相對表達量STINGIFN?αIFN?βCHB組888．97±1．959．04±3．139．14±2．74對照組7410．53±2．1510．69±2．9810．15±2．82ΔΔCt-1．56-1．651．012-ΔΔCt2．953．142．01t-4．72-3．41-2．31P<0．01<0．01<0．05

2.3 不同HBV DNA載量CHB患者STING及干擾素基因表達量的比較 根據CHB患者體內HBV DNA病毒載量的不同將其分為HBV DNA ≤104IU/mL組、104～IU/mL組、105～IU/mL組和>106IU/mL組，使用方差分析檢驗四組的差異，結果顯示四組不同HBV DNA載量的CHB患者STING表達有差異，且差異有統計學意義(P=0.01)；四組不同HBV DNA載量的CHB患者IFN-β表達有差異，且差異有統計學意義(P=0.048)。見表4。通過SNK檢驗對不同HBV DNA載量CHB患者STING基因表達量比較進行兩兩比較，結果發現，HBV DNA≤104IU/mL組患者與其他三組相比，STING基因相對表達量增高，分別是HBV DNA 104～IU/mL組、105～IU/mL組、>106IU/mL組的2.98、3.76、3.97倍，差異有統計學意義(P<0.05)。

HBVDNA載量(IU/mL)例數基因相對表達量STINGIFN?αIFN?β≤104組217．57±1．838．40±3．438．30±2．51104～組189．14±1．778．97±3．308．85±3．19105～組249．47±1．7310．14±2．5810．42±1．95>106組259．56±1．879．04±3．138．83±2．945χ25．791．492．75P0．010．2230．048

2.4 CHB患者STING表達量與干擾素基因表達量以及HBV DNA載量的相關性 CHB患者STING mRNA表達量與IFN-α 和IFN-β mRNA表達量呈正相關(r值分別為0.475和0.503，P值均<0.05)，與HBV DNA 載量呈弱相關性(r=0.333，P<0.05)。

3 討論

固有免疫是人體抵御病原微生物感染的第一道防線，可通過PRRs精細識別出不同的抗原，并激活下游免疫信號通路，最終生成IFN和其他細胞因子限制病原微生物對人體的侵襲[13]。固有免疫很大程度地影響著感染的最終結局，同時也是適應性免疫的基礎[14]。STING是DNA傳感器環鳥苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS)和RNA傳感器人視黃酸誘導基因(retinoic acid-inducible gene I，RIG-I)下游的細胞信號級聯中的銜接蛋白，其介導的信號傳導通路可以識別多種入侵病毒[15]。HBV病毒基因組全長約3.2 kb，為部分雙鏈環狀DNA，其在宿主體內可以轉變為超螺旋的共價、閉合、環狀DNA分子，并作為模板轉錄出前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)和其他mRNA。雖然肝臟是HBV復制的主要部位，但是人體外周血中也可以檢測到HBV DNA。HBV通常被認為是一種“隱形”病毒，因為在HBV感染的自然過程中，固有免疫反應很弱甚至不存在，可能是由于固有免疫系統雖然可以識別到HBV，但病毒可以主動抑制或逃避早期抗病毒反應[16]。實際上，最近的研究表明，HBV的前基因組RNA和其松弛的環狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，可分別被RIG-I和STING識別[17]。不同的先天免疫信號通路的激活可誘導IFN應答并抑制HBV復制。另一方面，越來越多的證據表明不同的HBV蛋白和HBV病毒粒子可以通過各種機制損害先天免疫信號，如RIG-I，Toll樣受體3(Toll-like receptor，TLR3)和STING刺激的信號[18]。如HBV誘導的miR146a可靶向干擾RIG-I，從而減弱IFN產生[19]。HBV X蛋白與線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling，MAVS)相互作用，P蛋白競爭RNA解旋酶3(DDX3)與TANK結合激酶1(TBK1)的結合，以抑制RIG-I介導的I型IFN通路信號傳導[8]。

最近的研究[20]表明，cGAS-STING通路的激活可以有助于抑制的HBV復制。cGAS是細胞質dsDNA感受器，可結合細胞質中的DNA經催化后形成cGAMP。cGAMP能有效激活STING，進而激活下游Ⅰ型IFN生成及抗病毒效應。由于HBV復制期間可產生dsDNA和ssDNA，因此，STING也參與HBV復制中間體的識別和HBV清除的調節[21]。本研究發現，CHB組患者與健康對照組相比較，其STING表達量是增多的，且在HBV DNA載量低的患者體內，其STING的表達也是增多的。與Liu等[22]的體外細胞實驗及小鼠動物實驗中的結果一致，即過度表達的STING在體外和體內均可抑制HBV的復制，而且除了固有免疫反應外，STING也調節機體對HBV的適應性免疫反應。同時，本研究中還發現，STING的相對表達量與IFNα、IFNβ的表達呈正相關，與最近報道[23]的有關STING與干擾素基因的研究類似。

綜上所述，STING在機體抗HBV免疫應答中發揮著重要作用，由于本研究納入樣本量有限，關于STING抗HBV感染的確切機制還需進一步研究確認。對于STING介導的固有免疫網絡亦有待完善，從而為進一步探明病毒逃避宿主固有免疫的機制，并為HBV感染的治療提供新的思路和靶點。

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