BBI阻斷LPS對腸道上皮細胞間緊密連接蛋白的抑制作用

古 俊, 劉金彪, 霍文哲

(武漢大學基礎醫學院，湖北 武漢 430071)

腸道是人體最重要和最復雜的器官之一，它不僅為機體各個器官組織提供營養物質，也為微生物的生存提供必要的空間與營養條件。人類的許多疾病都伴有腸道功能紊亂以及菌群失調癥狀。因此，腸道的功能表現也是反映機體健康的直接和重要指標之一[1]。腸道上皮細胞在血液循環和腸道內的外環境間形成一道天然屏障，是阻擋腸道內微生物及其產物進入機體的第一道重要防線，對維持腸道內動態平衡和正常功能至關重要[2]。腸道上皮細胞能吸收對機體有益的物質，并特異性地排斥病原體等有害物質[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一種感染性細菌(革蘭陰性細菌)的產物，可誘導包括巨噬細胞在內的免疫細胞和非免疫細胞表達大量的炎癥因子，引起炎癥反應。LPS誘導產生的炎癥因子會損傷腸道上皮屏障，改變屏障的通透性[4]。腸道內菌群紊亂以及腸道上皮屏障受損會導致LPS的移位，進入血液循環，進一步加劇炎癥反應。在艾滋病等多種感染性疾病以及腸炎等非感染性疾病中，腸道免疫紊亂及腸道屏障破壞是主要的病理變化[5]。

包曼-畢爾克抑制劑(Bowan-Birk inhibitor，BBI)是一種大豆富含的耐酸性蛋白酶抑制劑，具有抗炎功效[6]。研究表明，BBI能有效抑制炎性因子表達，對免疫性疾病具有潛在的治療功效[7-8]。BBI還能抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子的表達，減少炎性巨噬細胞造成的神經損傷[9]。我們的前期研究[10]顯示，BBI能激活巨噬細胞內天然免疫，抑制人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的感染和復制；BBI能抑制LPS誘導的腸道上皮細胞NF-κB激活，從而抑制炎癥因子的表達。大量研究表明，腸道還是HIV感染的主要場所。HIV感染使腸道CD4+T細胞丟失，造成腸上皮屏障通透性增加，細菌及其產物如LPS進入血液循環，引起全身性免疫激活，這是HIV感染進展到艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的主要原因。因此，抑制或降低LPS誘導的免疫激活有助于減緩HIV疾病進展。在這項研究中，我們選擇既有抗炎作用又能抑制HIV的天然產物BBI，研究BBI是否能阻斷LPS對腸道上皮細胞間緊密連接蛋白的抑制作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 LPS購于美國InvivoGen公司，其效價為106EU/mg(endotoxin Unit/mg)，用無內毒素的水溶解LPS(10 μg/μL)后保存于-80℃；BBI購于美國Sigma-Aldrich公司，其純度>90%，用高壓滅菌雙蒸水溶解BBI(10 mg/mL)后保存于-80℃；Tri-reagent購于美國Sigma-Aldrich公司；SsoAdvancedTM Universal Inhibitor-Tolerant SYBR○RGreen Supermix購于美國BIO RAD公司；CCK8試劑盒購于美國MCE公司。ZO-1兔單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，Occludin兔單克隆抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司，NF-κB和p-NF-κB兔單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養 HT-29細胞(人結腸癌上皮細胞系)購于ATCC細胞庫。在37℃、5%CO2的細胞培養箱中，用DMEM完全培養基(含10%胎牛血清、1%雙抗、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%HEPES緩沖液)培養HT-29細胞。

1.3 毒性試驗 用CCK8試劑盒檢測LPS和/或BBI對HT-29細胞的毒性作用。在96孔細胞培養板中培養HT-29細胞(104個/孔)，12 h后用不同濃度的LPS(0、0.1、1、10、100、1 000 ng/mL)、BBI(0、25、50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL)或BBI預處理后再用LPS處理細胞72 h。在每個培養孔中加入10 μL CCK8溶液，繼續培養4 h后，用全自動多功能酶標儀(在波長450 nm處)檢測吸光度值。

1.4 熒光定量PCR 用Tri-Reagent提取細胞RNA，然后用NANDROP超微量分光光度計(Thermo Scientific)檢測RNA濃度。根據說明書，用逆轉錄PCR試劑盒(Promega，USA)和隨機引物(Promega，USA)對RNA進行逆轉錄， 37℃擴增1 h，95℃終止反應。實時熒光定量PCR用SYBR Green Supermix試劑盒。反應條件為95℃預變性1 min，95℃ 5 s→60℃ 10 s，40個循環。實驗所使用引物見表1。Ct值相對GAPDH進行均一化，采用2-△△Ct法計算mRNA的表達水平。

1.5 蛋白質印跡法(Western Blot) 在6孔板中按2×106個/孔培養HT-29細胞。用RIPA中強度裂解液(碧云天生物技術公司)提取LPS或BBI處理過的細胞蛋白，RIPA中加入蛋白磷酸酶抑制劑(北京普利萊基因技術有限公司)。用8% SDS-PAGE膠分離40 μg總蛋白，然后轉至PVDF膜(Biro Rad公司)，5%脫脂奶粉封閉，再用稀釋的ZO-1兔單克隆抗體(1∶1 000)，Occludin兔單克隆抗體(1∶1 000)，NF-κB及p-NF-κB兔單克隆抗體(ser-536，1∶1 000)，4℃孵育過夜，充分洗滌后用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育3 h，洗滌后用增強型化學發光劑ECL(碧云天生物技術公司)在化學發光成像儀上顯影。用Image J圖像軟件分析條帶密度。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 BBI和/或LPS對腸道上皮細胞的毒性作用 用CCK8試劑盒檢測細胞活性，將未處理的細胞在波長490 nm處的吸光度值定為1.0，以此計算處理細胞和未處理細胞的百分比值，重復3次實驗，每次實驗的三個復孔取均數±標準差。用不同濃度LPS和/或BBI處理HT-29細胞72 h，處理的細胞和未處理細胞的活性相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1A。先用BBI預處理細胞6 h，再用不同濃度LPS處理細胞，處理的細胞和未處理細胞的活性相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1B。BBI最大濃度(1 000 μg/mL)和LPS最大濃度(1 000 ng/mL)，對細胞均無毒性作用。

A：用不同濃度LPS和/或BBI處理HT-29細胞72 h；B：用BBI預處理細胞6 h，再用不同濃度LPS繼續處理72 h

2.2 BBI阻斷LPS對腸道上皮細胞間緊密連接蛋白的抑制作用 提取細胞RNA，實時熒光定量PCR檢測緊密連接蛋白ZO-1、Occludin以及GAPDH的mRNA水平表達，數據采用2-△△Ct法計算，重復3次實驗，每次實驗的三個復孔取均數±標準差。LPS可顯著地下調HT-29細胞間緊密連接蛋白(ZO-1, Occludin)在mRNA和蛋白水平的表達，其下調作用與LPS濃度成正比。BBI預處理6 h 能抑制LPS對HT-29細胞緊密連接蛋白的下調作用，且這種抑制效應與BBI劑量成正相關。見圖2。

2.3 BBI 對LPS誘導的腸道上皮細胞TLR4表達的影響 提取細胞總RNA，實時熒光定量PCR檢測細胞TLR4以及GAPDH在mRNA水平的表達，數據采用2-△△Ct法計算，重復3次實驗，每次實驗的三個復孔取均數±標準差。LPS能顯著上調HT-29細胞TLR4受體的表達，且上調作用具有時間和劑量效應。LPS處理HT-29細胞3 h時對TLR4mRNA水平的上調作用最明顯，見圖3A。在10 ng/mL濃度時，LPS對TLR4的誘導作用最強，見圖3B。BBI預處理HT-29細胞6 h可明顯抑制LPS對TLR4的上調作用，而且BBI的這種抑制作用具有劑量效應，見圖3C。

A：按不同時間(0、3、6、12、24 h)用LPS(10 ng/mL)處理HT-29細胞，檢測LPS對ZO-1和Occludin表達的影響；B：用不同濃度BBI預處理細胞6 h，再用LPS處理6 h，檢測BBI對LPS的阻斷作用；C：用不同濃度LPS處理HT-29細胞24 h；或用不同濃度BBI預處理細胞6 h，再用LPS處理24 h；Western Blot檢測細胞ZO-1、Occludin以及內參β-actin蛋白水平表達；*：P<0.05；**：P<0.01

圖2BBI阻斷LPS對HT-29細胞緊密連接蛋白的抑制作用

Figure2BBI blocks LPS-mediated inhibitory effect on tight junction protein in HT-29 cells

A：按不同時間點(0、3、6、12、24 h)用LPS(10 ng/mL)處理HT-29細胞；B：用不同濃度的LPS處理HT-29細胞；C：用不同濃度BBI預處理細胞6 h，再用LPS(10 ng/mL)處理3 h；*：P<0.05；**：P<0.01

圖3BBI阻斷LPS對TLR4的作用

Figure3BBI blocks LPS-mediated effect on TLR4

2.4 BBI對腸道上皮細胞炎癥因子、TLR4及MyD88表達的影響 用BBI(100 μg/mL)處理HT-29細胞，提取細胞RNA，用實時熒光定量PCR檢測細胞TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、TLR4、MyD88以及GAPDH的mRNA表達，數據采用 2-△△Ct法計算，重復3次實驗，每次實驗的三個復孔取均數±標準差。高濃度BBI(100 μg/mL)處理HT-29細胞對炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1)、TLR4以及MyD88的表達無明顯作用。BBI處理時間長短(3、6、12、24 h)對上皮細胞炎癥因子表達也無影響(P>0.05)。見圖4。

2.5 BBI對LPS誘導的腸道上皮細胞NF-κB活化的影響 用含蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞蛋白，Western Blot檢測細胞磷酸化的N F-κB。LPS能顯著地促進HT-29細胞內NF-κB的磷酸化，這種促NF-κB磷酸化的作用具有劑量效應。BBI對NF-κB的磷酸化無影響，而BBI預處理HT-29細胞6 h能明顯阻斷LPS對NF-κB的磷酸化的促進作用。見圖5。

圖4 BBI對HT-29細胞表達炎癥因子、TLR4和MyD88的影響

A：用不同濃度LPS處理HT-29細胞30 min；B：用LPS(10 ng/mL)處理HT-29細胞后，按不同時間點(0、5、15、30、60、120 min)檢測細胞NF-κB；C：用不同濃度BBI預處理細胞6 h后再用LPS(10 ng/mL)處理HT-29細胞30 min

圖5BBI對LPS誘導腸道上皮細胞NF-κB的磷酸化的影響

Figure5Effect of BBI on LPS-mediated phosphorylation of NF-κB in the intestinal epithelial cells

3 討論

腸道上皮細胞是腸道屏障的重要組成部分，腸道屏障對保護腸道不受病原微生物入侵至關重要，以腸道上皮屏障的通透性作為疾病防治靶標越來越受到重視[11-12]。研究表明，細菌內毒素LPS能通過TLR4受體募集MyDD8，激活NF-κB，誘導腸道上皮細胞表達包括TNF-α、IL-1β、IL-8在內的大量炎性因子，導致腸道上皮細胞通透性增加，屏障損傷[13-14]，導致腸道內微生物及其產物移位，進入血液循環，引起全身性免疫激活[15-16]。由于HIV感染的主要靶細胞是CD4+T細胞，免疫激活成為HIV感染進展主要促進因素。因此，維持腸道完整性至關重要。腸道上皮細胞通過緊密連接蛋白維持上皮屏障的穩定[17]。Occludin是第一個被發現的細胞間緊密連接蛋白，表達于所有上皮細胞，在上皮屏障細胞結構和功能中均發揮重要作用[18]。ZO-1是細胞間帶狀緊密連接蛋白，是上皮細胞結構和功能的主要標志[19-20]。本研究顯示，LPS處理腸道上皮細胞能明顯地降低緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達。此外，LPS還能誘導腸道上皮細胞表達TLR4，有利于LPS發揮功效。LPS能激活腸道上皮細胞NF-κB，促進炎癥因子表達。然而，BBI預處理能阻斷LPS對細胞間緊密連接蛋白的抑制作用，BBI還能抑制LPS誘導的TLR4表達和NF-κB活化。這些結果為BBI對LPS的抑制作用提供了合理的解釋。

LPS誘導產生的炎性因子是導致腸道屏障損傷及免疫激活的主要因素。機體免疫激活及腸道LPS移位促進HIV-1疾病進展。新近研究顯示，LPS增加腸道上皮細胞通透性，損傷腸道屏障。由于緊密連接蛋白(ZO-1，Occludin)是形成細胞間空隙、控制腸道內物質進入體內的重要蛋白，抑制其表達會造成腸上皮屏障通透性增加，細菌及其產物如LPS進入血液循環，進一步加劇炎癥反應，使HIV有更多靶細胞。因此，本研究結果表明，BBI能保護腸道上皮細胞不受LPS介導的炎性損傷，有利于降低和減緩HIV感染的進展。

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