小鼠Bcl2a1a蛋白的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析

楊筱舟，楊淵，李明陽(yáng)，馬春霞，陳元鼎

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118

B細(xì)胞淋巴瘤因子2（BCL2）是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其主要功能是控制內(nèi)源性凋亡途徑中線粒體細(xì)胞色素C的釋放[1-2]。BCL2包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，以多種方式相互作用誘導(dǎo)或抑制線粒體膜外孔的形成[3-6]。由于在凋亡機(jī)制中起關(guān)鍵作用，BCL2蛋白常在癌細(xì)胞中失調(diào)。因此，許多BCL2抗凋亡蛋白基因被確定為重要的細(xì)胞內(nèi)致癌基因，成為抗癌治療的靶點(diǎn)。

BCL2相關(guān)蛋白A1（BCL2A1）主要在造血系統(tǒng)中表達(dá)，并通過(guò)螯合促凋亡BCL2蛋白發(fā)揮其抗凋亡功能。然而，若BCL2A1在多種癌細(xì)胞，包括血液惡性腫瘤和實(shí)體瘤中過(guò)度表達(dá)，則可能促進(jìn)腫瘤發(fā)展[7]。

BCL2A1的轉(zhuǎn)錄受高度調(diào)節(jié)，可被粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、脂多糖和腫瘤壞死因子誘導(dǎo)產(chǎn)生[8-10]，并被鑒定為NF-κB的靶基因[11]。BCL2A1在CD40信號(hào)通路中可上調(diào)B淋巴細(xì)胞存活率[12-14]，也可通過(guò)PI3K和ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)表達(dá)。BCL2A1也受翻譯后水平調(diào)控，如泛素/蛋白酶體途徑的調(diào)控、組成型蛋白酶體介導(dǎo)的周轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的半衰期縮短[15-16]。

研究表明，人BCL2A1mRNA廣泛分布于肺、小腸、睪丸和平滑肌細(xì)胞，而可能由于表達(dá)模式的差異，小鼠Bcl2a1mRNA幾乎只在造血細(xì)胞中表達(dá)[10]。小鼠Bcl2a1包含4個(gè)拷貝，即A1-a、A1-b、A1-c和 A1-d。A1-a、A1-b、A1-d幾乎相同，A1-c含有導(dǎo)致截短轉(zhuǎn)錄物的點(diǎn)突變[17]。總的來(lái)說(shuō)，鼠和人的BCL2A1蛋白具有72%的氨基酸同一性及非常相似的結(jié)構(gòu)[18-19]。我們以小鼠Bcl2a1中的A1-a為對(duì)象，進(jìn)行一系列生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

登錄NCBI，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.nc?bi.nlm.nih.gov/gene/）中搜索小鼠（MUS）Bcl2a1a基因，獲得其全長(zhǎng)基因序列（Gene ID：12044）和氨基酸序列（NP_033872.1）；再搜索人類（HOMO）BCL2A1基因，獲得其全長(zhǎng)基因序列（Gene ID：597）和氨基酸序列（NP_004040.1），并保存為FASTA格式。

1.2 方法

用NCBI中的BLASTN（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）基因序列對(duì)比工具對(duì)人類BCL2A1基因和小鼠的Bcl2a1a基因進(jìn)行比對(duì)，獲得同源區(qū)段。用啟動(dòng)子在線分析軟件Promoter 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）、Network Promoter Predic?tion（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）對(duì)小鼠Bcl2a1a基因的啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)。用MerhPrimer CpG Island Prediction（http://www.uro?gene.org/cgi-bin/methpeimer/methprimer.cgi）預(yù) 測(cè) 小鼠Bcl2a1a基因中的CpG島分布情況。用Prot?Param（http://web.expasy.org/protparam/）分 析 小 鼠Bcl2a1a蛋白的理化性質(zhì)，包括相對(duì)分子質(zhì)量、分子式、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均疏水指數(shù)等。用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析小鼠Bcl2a1a蛋白的疏水性。用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域。用Signal P（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析信號(hào)肽。登陸ExPASy網(wǎng)站，利用SOPMA工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)Bcl2a1a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域搜索。登陸SMART網(wǎng)站，輸入Bcl2a1a氨基酸序列，分析其功能域和相互作用網(wǎng)絡(luò)。用PredictProtein（https://www.predictprotein.org/）分析跨膜螺旋區(qū)域、二硫橋及結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)。用Swiss_model（http://swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件預(yù)測(cè)分析Bcl2a1a蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Bcl2a1a基因序列分析

小鼠Bcl2a1a基因長(zhǎng)5497 bp，位于9號(hào)染色體，包含2個(gè)編碼區(qū)，分別位于132～551和5253～5351 bp，可編碼172個(gè)氨基酸殘基。

人源BCL2A1蛋白有2種異構(gòu)體，此處以第一種異構(gòu)體來(lái)與小鼠Bcl2a1a進(jìn)行基因序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者的同源區(qū)域在≥200 bp處。

2.2 小鼠Bcl2a1a基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果

2種軟件對(duì)Bcl2a1a基因啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)結(jié)果有所差異，Network Promoter Prediction測(cè)出小鼠Bcl2a1a的啟動(dòng)子區(qū)域有2個(gè)，最高分區(qū)域?yàn)?493～3543 bp。Promoter 2.0測(cè)出的鼠源Bcl2a1a啟動(dòng)子區(qū)域有3個(gè)，最可能的位點(diǎn)是4600 bp。結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)Bcl2a1a基因進(jìn)行CpG島預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2，沒(méi)有預(yù)測(cè)到CpG島的存在，所以本次啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率較低。

2.3 小鼠Bcl2a1a蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)ProtParam預(yù)測(cè)小鼠Bcl2a1a蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表2。該蛋白不含色氨酸殘基，序列的N端可能是甘氨酸殘基。

2.3.1 Bcl2a1a蛋白親疏水性分析 用ProtScale計(jì)算蛋白質(zhì)親疏水性分布圖，用Hphob/Kyte&Doo?little標(biāo)度，如圖3所示。橫坐標(biāo)表示氨基酸位置，縱坐標(biāo)表示標(biāo)度得分，＜0表示親水，＞0表示疏水。可以明顯看出疏水性峰值多于親水性峰值，由此推測(cè)此蛋白為疏水性蛋白，不溶于水。各個(gè)氨基酸殘基打分分值見(jiàn)表3。

圖1 人類BCL2A1與小鼠Bcl2a1a基因的同源區(qū)段

圖2 小鼠Bcl2a1a基因CpG島分布

表1 Bcl2a1a基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)

表2 Bcl2a1a理化性質(zhì)分析表

圖3 Bcl2a1a蛋白氨基酸序列親水性與疏水性預(yù)測(cè)

2.3.2 跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與信號(hào)肽分析 蛋白質(zhì)如果具有跨膜功能，則它在膜內(nèi)可以與膜脂結(jié)合，并被運(yùn)輸?shù)侥ね狻５鞍着c膜脂結(jié)合的部分即為跨膜區(qū)域。圖4A為利用TMHMM跨膜螺旋預(yù)測(cè)算法得到的Bcl2a1a跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果。紅色細(xì)線為跨膜區(qū)域，可知Bcl2a1a跨膜區(qū)域基本為零，說(shuō)明該蛋白不是跨膜蛋白。但是此軟件的陰性結(jié)果并不十分可信，因而繼續(xù)檢測(cè)其信號(hào)肽來(lái)推測(cè)該蛋白是否可以分泌到胞外行使功能。信號(hào)肽一般在蛋白質(zhì)N端，極少超過(guò)45個(gè)氨基酸殘基。本次使用的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法結(jié)果主要涉及3個(gè)值，C值代表信號(hào)肽酶切位點(diǎn)值，S值代表信號(hào)肽區(qū)域值，Y值為綜合考慮C值和Y值所得參數(shù)，其比單獨(dú)考慮C值要更加精確。如圖4B所示，軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示mean S在1～33位點(diǎn)，值為0.123，小于分泌型蛋白的標(biāo)準(zhǔn)值0.5。再結(jié)合TMHMM的結(jié)果，可知Bcl2a1a為胞內(nèi)蛋白而非分泌型蛋白，須裂解細(xì)胞后才可以收集。

表3 氨基酸分值表

2.4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

用SOPMA工具預(yù)測(cè)Bcl2a1a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5，最長(zhǎng)的藍(lán)色豎線為α螺旋，紅色豎線為延伸鏈，綠色豎線為β轉(zhuǎn)角，最短的紫色豎線為無(wú)規(guī)則卷曲。Bcl2a1a蛋白的氨基酸序列由55.81%的α螺旋、18.60%的無(wú)規(guī)卷曲、17.44%的延伸鏈和8.14%的β轉(zhuǎn)角構(gòu)成。α螺旋為Bcl2a1a蛋白的主要折疊形式。

圖4 Bcl2a1a跨膜區(qū)（A）和信號(hào)肽（B）預(yù)測(cè)

圖5 Bcl2a1a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4.1 模體預(yù)測(cè) 模體屬于蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，表示蛋白中具有特定空間構(gòu)象和特定功能的結(jié)構(gòu)成分。用NCBI的Conserved Domain Search Ser?vice（CD Search）軟件，輸入 Bcl2a1a的氨基酸序列，獲得該蛋白的模體預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6），包含BH1、BH2、BH3區(qū)域，與細(xì)胞凋亡規(guī)律有關(guān)。

2.4.2 結(jié)構(gòu)域與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用Smart軟件預(yù)測(cè)的Bcl2a1a蛋白結(jié)構(gòu)域和相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果如圖7所示。該蛋白37～140位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于一個(gè)BCL結(jié)構(gòu)域；該蛋白與Bbc3、Apaf1、Bcl2l2、Trp53、Bak1、Bid、Nfkb1、Jun、Rel、Rela等蛋白形成相互作用網(wǎng)絡(luò)。

圖6 模體結(jié)構(gòu)

圖7 Bcl2a1a蛋白的功能域預(yù)測(cè)（A）和相互作用分析（B）

圖8 預(yù)測(cè)Bcl2a1a蛋白信息

2.4.3 蛋白信息預(yù)測(cè) 如圖8所示，菱形為蛋白結(jié)合位點(diǎn)，紅色方框表示存在螺旋區(qū)域，橘黃色圓圈為多核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，紫色方框?yàn)槁懵恫糠郑S色方框?yàn)殡[藏部分，綠色方框?yàn)闊o(wú)序區(qū)域，藍(lán)色條帶為結(jié)合TrEMBL位點(diǎn)，綠色條帶為結(jié)合Swiss-prot位點(diǎn)，紅色條帶為結(jié)合PDB位點(diǎn)。該蛋白存在11個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)多核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，含大量螺旋區(qū)域。

2.5 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用Swiss-model構(gòu)建Bcl2a1a蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。利用同源建模方法，以Bcl2a1、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子BAX及Bcl-2-like protein 2作為建模的模板，最終得到的Bcl2a1a蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖9所示，其中包含大量α螺旋，少量無(wú)規(guī)卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角。預(yù)測(cè)結(jié)果與用SOPMA軟件預(yù)測(cè)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)性質(zhì)吻合。

3 討論

小鼠Bcl2a1a和人類BCL2A1基因的同源區(qū)域?yàn)椤?00 bp處，小鼠Bcl2a1a基因最可能的啟動(dòng)子區(qū)域是3493～3543和4600 bp。Bcl2a1a蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量為460 087.23，理論等電點(diǎn)為4.76，脂肪系數(shù)為31.00，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)44.43大于40，說(shuō)明蛋白不穩(wěn)定，總平均疏水性0.712大于0，預(yù)測(cè)為疏水性蛋白，所以該蛋白是一種不穩(wěn)定的疏水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明Bcl2a1a蛋白無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)域，存在11個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)多核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，含大量螺旋區(qū)域，α螺旋為主要折疊形式。運(yùn)用同源建模法，使用在線建模軟件Swiss-model構(gòu)建Bcl2a1a蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，表明該蛋白含有1個(gè)BCL結(jié)構(gòu)域，且與一些蛋白形成相互作用網(wǎng)絡(luò)。

圖9 Bcl2a1a蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

細(xì)胞凋亡是生物細(xì)胞主動(dòng)消亡的程序性活動(dòng)，是多細(xì)胞機(jī)體調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控細(xì)胞衰老、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡過(guò)程被精細(xì)準(zhǔn)確地調(diào)控。作為BCL-2蛋白家族的一員，BCL2A1可以減少線粒體釋放促腫瘤細(xì)胞色素C，從而抑制細(xì)胞凋亡。BCL2A1與許多疾病有關(guān)，比如在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，BCL2A1高表達(dá)與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，表明BCL2A1在同質(zhì)人群中與病情預(yù)后有關(guān)[20]；此外，BCL2A1在Mantle細(xì)胞淋巴瘤及各種大B細(xì)胞淋巴瘤中高表達(dá)。除了在血液系統(tǒng)異常表達(dá)外，BCL2A1 mRNA在實(shí)體腫瘤中也過(guò)度表達(dá)，如乳腺癌，已發(fā)現(xiàn)斷奶后懷孕小鼠中Bcl2a1 mRNA上調(diào)，通過(guò)阻止細(xì)胞凋亡來(lái)阻止乳腺退化[21]；如胃腸癌，與正常組織相比，BCL2A1 mRNA在胃癌中過(guò)表達(dá)，表明BCL2A1也可能在實(shí)體瘤中發(fā)揮作用[22]；另外還有肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌[23]和黑色素瘤[24]，其中乳腺癌樣本中檢測(cè)到BCL2A1 mRNA的最高表達(dá)[25]。

在實(shí)際應(yīng)用中，BCL2A1抑制劑可用于癌癥治療，因其抗凋亡功能，BCL-2蛋白已被確定為抗癌治療的靶標(biāo)。目前，幾種BCL-2蛋白的小分子抑制劑正進(jìn)行多種惡性腫瘤（包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病）臨床試驗(yàn)。盡管BCL2A1在許多不同類型的癌癥中過(guò)表達(dá)，但通過(guò)小分子抑制劑對(duì)BCL2A1進(jìn)行抑制是開(kāi)發(fā)抗癌治療劑的新希望。

本研究由小鼠Bcl2a1a基因序列出發(fā)，對(duì)其蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到了相關(guān)的理化性質(zhì)和基本特征。因?yàn)楹腿祟怋CL2A1為同源基因，所以以小鼠為模型進(jìn)行上述疾病的研究是一種很好的選擇。本實(shí)驗(yàn)為該基因以及相關(guān)疾病的進(jìn)一步研究提供了參考，然而運(yùn)用生物信息學(xué)研究基因和蛋白并不能保證結(jié)果完全準(zhǔn)確，仍然需要實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作完成。

[1] Adams J M,Cory S.The Bcl-2 protein family:arbi?ters of cell survival[J].Science,1998,281(5381):1322-1326.

[2] Nu?ez G,Clarke M F.The Bcl-2 family of proteins:regulators of cell death and survival[J].Trends Cell Bi?ol,1994,4(11):399-403.

[3] Minn A J,Kettlun C S,Liang H,et al.Bcl-xL regu?lates apoptosis by heterodimerization-dependent andindependentmechanisms[J].EmboJ,1999,18(3):632-643.

[4] Matsuyama S,Schendel S L,Xie Z,et al.Cytoprotec?tion by Bcl-2 requires the pore-forming alpha5 and alpha6 helices[J].J Biol Chem,1998,273(47):30995-31001.

[5] Sokolova N,Provazza S,Ainbinder A,et al.The puta?tive pore-forming domain of Bax regulates mitochondri?al localization and interaction with Bcl-X(L)[J].Mol Cell Biol,2000,20(5):1604-1615.

[6] Heimlich G,Mckinnon A D,Bernardo K,et al.Baxinduced cytochrome c release from mitochondria de?pends on alpha-helices-5 and-6[J].Biochem J,2004,378(1):247-255.

[7] Vogler M.BCL2A1:the underdog in the BCL2 family[J].Cell Death Differ,2012,19(1):67-74.

[8] Orlofsky A,Berger M S,Prystowsky M B.Novel ex?pression pattern of a new member of the MIP-1 fami?ly of cytokine-like genes[J].Cell Regul,1991,2(5):403.[9] Lin E Y,Orlofsky A,Berger M S,et al.Characteriza?tion ofA1,anovelhemopoietic-specificearly-re?sponse gene with sequence similarity to bcl-2[J].J Im?munol,1993,151(4):1979-1988.

[10]Karsan A,Yee E,Kaushansky K,et al.Cloning of hu?man Bcl-2 homologue:inflammatory cytokines induce human A1 in cultured endothelial cells[J].Blood,1996,87(8):3089-3096.

[11]Zong W X,Edelstein L C,Chen C,et al.The prosur?vival Bcl-2 homolog Bfl-1/A1 is a direct transcription?al target of NFB that blocks TNF-induced apoptosis[J].Genes Dev,1999,13(4):382-387.

[12]Lee H H,Dadgostar H,Cheng Q,et al.NF-κB-medi?ated up-regulation of Bcl-x and Bfl-1/A1 is required for CD40 survival signaling in B lymphocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(16):9136.

[13]Craxton A,Chuang P I,Shu G,et al.The CD40-in?ducibleBcl-2 familymemberA1 protectsB cells from antigen receptor-mediated apoptosis[J].Cell Im?munol,2000,200(1):56-62.

[14]Kater A P,Evers L M,Remmerswaal E B,et al.CD40 stimulation of B-cell chronic lymphocytic leu?kaemia cells enhances the anti-apoptotic profile,but also Bid expression and cells remain susceptible to au?tologous cytotoxic T-lymphocyte attack[J].Br J Haema?tol,2004,127(4):404-415.

[15]Herold M J,Zeitz J,Pelzer C,et al.The stability and anti-apoptotic function of A1 are controlled by its C terminus[J].J Biol Chem,2006,281(19):13663-13671.

[16]Kucharczak J F,Simmons M J,Duckett C S,et al.Constitutive proteasome-mediated turnover of Bfl-1/A1 and its pro cessing in response to TNF receptor acti?vation in FL5.12 pro-B cells convert it into a pro?death factor[J].Cell Death Differ,2005,12(9):1225.

[17]Hatakeyama S,Hamasaki A,Negishi I,et al.Multiple gene duplication and expression of mouse bcl-2-relat?ed genes,A1[J].Int Immunol,1998,10(5):631-637.

[18]Herman M D,Nyman T,Welin M,et al.Completing the family portrait of the anti-apoptotic Bcl-2 pro?teins:crystal structure of human Bfl-1 in complex with Bim[J].FEBS Lett,2008,582(25-26):3590.

[19]Smits C,Czabotar P,Hinds M,et al.Structural plastic?ity underpins promiscuous binding of the prosurvival protein a1[J].Structure,2008,16(5):818.

[20]Morales A A,Olsson A,Celsing F,et al.High expres?sion of bfl-1 contributes to the apoptosis resistant phe?notype in B-cell chronic lymphocytic leukemia[J].Int J Cancer,2005,113(5):730-737.

[21]Capuco A V,Li M,Long E,et al.Concurrent pregnan?cy rRetards mammary involution:effects on apoptosis and proliferation ofthe mammary epithelium after forced weaning of mice1[J].Biol Reprod,2002,66(5):1471-1476.

[22]Choi S S,Park I C,Yun J W,et al.A novel Bcl-2 related gene,Bfl-1,is overexpressed in stomach can?cer and preferentially expressed in bone marrow[J].On?cogene,1995,11(9):1693.

[23]Haq R,Yokoyama S,Hawryluk E B,et al.BCL2A1 is a lineage-specific antiapoptotic melanoma oncogene thatconfers resistance to BRAF inhibition[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(11):4321-4326.

[24]Riker A I,Enkemann S A,Fodstad O,et al.The gene expression profiles of primary and metastatic mel?anoma yields a transition point of tumor progression and metastasis[J].Bmc Med Genomics,2008,1(1):1-16.

[25]Beverly L,Varmus H.MYC-induced myeloid leukemo?genesis is accelerated by all six members of the anti?apoptotic BCL family[J].Oncogene,2009,28(9):1274-1279.