長鏈非編碼RNA研究進展

韓聰，胡建宏，胡姍，朱蓉慧，白玉恒，朱海鯨

1.榆林學院 陜西省絨山羊工程技術研究中心，陜西 榆林 719000；2.榆林學院 生命科學研究中心，陜西 榆林 719000；3.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100

在哺乳動物中，75%的基因組是可轉錄的，絕大多數轉錄本是非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），只有2%編碼蛋白質[1-2]。近年的研究結果表明，ncRNA具有多種重要的生物學功能，在表觀遺傳學水平、轉錄及轉錄后水平調節基因表達，與胚胎發育、腫瘤發生及物種進化等有十分密切的聯系[3]?？砂创笮cRNA分為2類：小非編碼RNA和長鏈非編碼RNA。小非編碼RNA長度少于200 bp，包括轉運RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）、核小 RNA（snRNA）、核仁小 RNA（snoRNA）、微小 RNA（microRNA）、小干擾 RNA（siRNA）和與piwi蛋白相互作用的piRNA[4-8]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）包括所有轉錄本大于200 bp的ncRNA，是數量龐大、種類繁雜、功能多樣的RNA[9]。大量研究表明，lncRNA與許多疾病的發生密切相關，尤其是與腫瘤的發生和轉移相關[10-14]。所以，與lncRNA相關的研究有重要意義。在此，我們著重從ln?cRNA分類、主要功能，及其在個體發育、腫瘤發生中的作用等方面對其進行簡要綜述。

1 lncRNA概述

lncRNA是一類轉錄本長度大于200 bp，缺乏開放讀框（ORF）的功能性ncRNA。與mRNA相似，大多數lncRNA也在RNA聚合酶Ⅱ的作用下完成轉錄[15-16]，具有 5′-甲基化帽子及 3′-多聚腺苷酸（polyA）尾。大多數lncRNA的生物合成途徑也總與mRNA密切相關[17]。隨著對lncRNA研究的深入，越來越多的不含polyA尾的lncRNA被發現，這可能由RNA聚合酶Ⅲ介導轉錄[17-18]。

與mRNA相比，lncRNA表達豐度較低，在細胞發育、分化的特定階段表達，具有明顯的組織細胞表達特異性。其他ncRNA，如miRNA、piRNA，序列高度保守，通過特定的堿基與目標基因配對在轉錄及轉錄后水平沉默相應基因。而lncRNA序列保守性較低，能通過多種不同機制在不同水平調節基因的表達。盡管lncRNA的一級結構保守性低，但其內部可能包含多個較短的高度保守區域，這些區域可能和特定因子作用或者形成特定二級結構而起作用[15]。此外，lncRNA在細胞中的定位較保守，亞細胞結構定位的特異性對lncRNA功能往往有決定性作用。

2 lncRNA分類

迄今發現的lncRNA多達15 000種[19]，而且數量還在不斷增加，可見lncRNA的種類相當豐富，可與蛋白媲美。為了更加系統地了解lncRNA，對其進行分類是必不可少的。由于lncRNA在來源、作用機制、功能等方面的異質性，其分類方式多種多樣，普遍接受的分類方法有以下2種：

根據lncRNA功能，可以分為：①信號分子，這類lncRNA一般包含具有調控功能的核酸序列，作為信號分子調控其他基因的表達；②誘餌分子，此類lncRNA作為誘餌分子招募其他RNA結合蛋白，共同調控目標基因的表達；③支架分子，這類lncRNA含有多種不同結構域，能與結合蛋白及其他分子結合，從而為復合體的裝配提供平臺；④引導分子，這類lncRNA作為RNA結合蛋白的引導分子，指導相應蛋白復合體定位到調控位點[20]。

根據lncRNA與鄰近蛋白編碼基因的相對位置，可以分為：①發散型（divergent），于鄰近的基因反義鏈轉錄并與其呈現發散趨勢；②收斂型（convergent），于鄰近基因反義鏈轉錄并與其呈現聚攏趨勢；③基因間（intergenic），于2個基因間的區域轉錄而來；④基因重疊型（overlapping），序列與蛋白編碼基因（有義鏈或無義鏈）有部分重疊；⑤增強子（enhancer），由增強子單向或雙向轉錄而來；⑥內含子（intronic），完全來源于另一個基因的內含子；⑦miRNA前體，其序列包含一個miRNA[21]。

3 lncRNA的主要作用

近年來，有關lncRNA的研究報道不斷增加，對lncRNA的研究也不斷深入。一些lncRNA分子在序列上存在與DNA直接相互作用的區域，與DNA之間發生堿基配對，或形成三股螺旋[16]。同時，一些lncRNA還能與其他RNA形成堿基互補，成為mRNA、miRNA及其他RNA表達的高特異性傳感器[9]。另外，lncRNA的二級結構對其功能也有重要作用，比如lncRNA-AIR中具有雙莖環結構，能與多梳抑制復合物（PRC2）相互作用。許多研究表明lncRNA具有多種重要功能，能參與X染色體失活、調控mRNA降解、參與細胞核亞結構的形成、調節染色質的重塑等。

3.1 lncRNA參與X染色體的失活

X染色體失活，即雌性哺乳類細胞中2條X染色體中的1條失去活性，從而消除雙劑量同一基因可能產生的毒性。在調控劑量補償效應的lncRNA中涉及多種lncRNA，研究最為深入的是Xist基因，主要在雌性動物體即將失活的那條X染色體中表達[22]，在X染色體失活中起重要作用。該位點轉錄產生2個lncRNA，RepA和 Tsix，其中RepA來自Xist基因并招募PRC2復合體使需要失活的X染色體區的H3K27三甲基化[23]，該甲基化方式可促進Xist基因的大量表達，從而起始X染色體失活，而Tsix是Tist的反義抑制因子，防止另一條X染色體失活[24]。Rsx是另一個與X染色體失活相關的lncRNA，它與Xist相似，覆蓋在其轉錄的X染色體上，通過順式作用沉默該X染色體上的基因。

3.2 調控mRNA的降解

mRNA的豐度由其轉錄本的量及降解的速度決定，部分lncRNA通過調控mRNA降解從而調節相關基因的表達水平。半-STAU1結合位點RNA（half-sbsRNA）能通過Alu元件與mRNA的3′非翻譯區（UTR）結合參與STAU1介導的mRNA降解。這種lncRNA的Alu元件與mRNA的Alu元件發生不完全配對，形成STAU1結合位點，促使mRNA與STAU1結合，這種結構能被雙鏈RNA（dsRNA）結合蛋白識別，觸發SMD（Staufen-mediated mRNA decay）途徑，從而介導mRNA降解[25]。

3.3 參與細胞核亞結構的形成

許多lncRNA富集參與組織特定的亞核結構。核散斑富含lncRNA MALAT1，又稱為核富集常染色體轉錄產物2（nuclear-enriched autosomal transcript 2，NEAT2），這種lncRNA在癌細胞中大量表達，是腫瘤轉移較強的預報器[26]。與MALAT1屬同一家族的核富集常染色體轉錄產物1（NEAT1）也參與細胞核亞結構的形成。細胞核亞結構副斑點（paraspeckles）于2002年被發現，廣泛存在于高等哺乳動物的組織和細胞系中，La?mond等研究表明RNase處理會破壞細胞的para?speckles結構[27]，后續又有研究表明NEAT1參與paraspeckles的組裝[28-29]。

3.4 調控染色質重塑

染色質狀態決定了轉錄活性，是調控基因表達的關鍵因素[30]。染色質結構的動態變化對細胞的生物學行為具有決定性作用，尤其是決定了細胞的分化、衰老、凋亡等命運，其異?？蓪е露喾N疾病[31]。最近的研究顯示，一些lncRNA通過影響染色質狀態來調控基因表達。研究[32]表明多種lncRNA可與染色質重構蛋白復合物PRC或其他染色質修飾復合物結合，其中常見的lncRNA有ANRIL和HOTAIR。

同源異型框基因反義基因間RNA（HOX an?ti-sense intergenic RNA，HOTAIR）由同源異型框基因 C（homeobox C，HOXC）位點轉錄。HOTAIR作為骨架分子，其5′端結合PRC2復合體從而抑制HOXD位點的轉錄，3′端與LSD1/CoREST/REST復合體結合移除活性染色質組蛋白標記從而加強對靶位點的定位[33]。INK4位點反義ncRNA（an?tisense ncRNA in the INK4 locus，ANRIL）是周期蛋白依賴性激酶抑制因子2B（cyclin-depen-dent kinase inhibitor 2B，CDKN2B，即 p15INK4b）基因的反義轉錄物，結合并募集PRC1和PRC2復合體，導致染色質狀態的改變，從而抑制抑癌基因周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A（CDKN2A，即p16INK4a）基因的表達，對抗細胞衰老并間接促進細胞周期活動[34-35]。

4 lncRNA與個體發育及疾病發生

近年來發現lncRNA是一類非常重要的真核生物轉錄產物，可以通過多種作用機制廣泛參與機體的各種生物學過程，并在真核生物的個體發育及疾病發生發展中起重要作用。廣泛的研究已經證實lncRNA參與各種哺乳動物的發育過程，哺乳動物早期發育過程中，lncRNA在器官形成及等位基因印跡中調節細胞的發育、分化[36]。與更廣泛表達的蛋白分子相比，大多數lncRNA呈現出組織特異性表達模式[20]，這有助于精細調整和協調相關信號以調節細胞生理。有趣的是，許多調節發育的lncRNA一旦發生改變就可能導致各種疾病的發生，包括癌癥[37]。最近的研究表明，在大多數情況下腫瘤干細胞是推動癌癥進展的主要因素。腫瘤干細胞與胚胎干細胞驚人地相似，這2種類型的細胞都具有無限增殖能力和遷移到特定位置的潛能。因此，關于許多lncRNA能導致各種疾病的研究是有意義的。

4.1 lncRNA與個體發育

H19是早期發現的印跡基因之一，通過基因組印跡抑制多個基因的表達，是調控基因表達的關鍵因素[38-40]。H19/Igf2基因屬于一個基因印跡群，Igf2基因是父源性印跡基因，而H19是母源性印跡基因，兩者毗鄰。母系的H19基因缺失會導致Igf2的表達增加，從而導致體重增加，而這種表型可以由一個Igf2基因的等位基因缺失得到消除。H19基因敲除小鼠不致命且可繁殖[41]，但是由于失去由H19基因編碼的2個miRNA而降低肌肉再生能力[42]。lncRNA-Fendrrfendrr從Foxf1啟動子發散轉錄，在胚胎存活和器官發育中起重要作用，研究表明下調Fendrr會導致心臟功能受損、體內壁發育缺陷、胚胎死亡[43]。近年來，lncRNA在神經元和腦發育過程中的表達已經引起了特別的關注。一些lncRNA與編碼重要的神經轉錄因子的PouⅢ基因pou3f3和pou3f2鄰近，被發現在神經元發育中發揮作用[44-46]。例如lncRNA-pantr1與pou3f3基因反向發散型轉錄，插入lacZ基因替換pantr1不影響pou3f3轉錄本身，但反式調控其他pou3f轉錄因子。lncRNA-Dali（DNMT1相關長鏈基因間RNA）在pou3f3下游轉錄，Dali的消耗導致pou3f3表達下調從而損害神經元的分化[47]。

生物體中有一類專門調控生物形體的Hox基因簇，一旦這類基因發生突變，就會導致身體的一部分變形。lncRNA與此現象相關，其中最主要的就是HOTAIR[48]。它代表了一類反式基因調節作用的lncRNA，正如它從哺乳動物的HOXC基因表達而在HOXD基因座發揮其作用。HOTAIR作為組蛋白修飾復合物的支架，5′端結合PRC2到特定基因位點使H3K27三甲基化，3′端結合組蛋白去甲基化酶復合體（LSD1/REST/co-REST）使第4位賴氨酸去二甲基化，從而使HOXD基因發生表觀遺傳學沉默，導致動物體發育畸形[35]。2011年，Wang等在HOXA基因上發現一種可激活發育相關基因表達的lncRNA-HOTTIP[49]。HOTTIP是HOXA基因5′端的轉錄本，與WDR5/MLL復合體結合，通過染色質纏繞接近目標基因，使H3K4三甲基化從而調控基因的轉錄[50]。在HOX基因的這些基因位點上蛋白質與lncRNA之間復雜的相互作用對正常胚胎發育是很關鍵的。HOTAIR基因的定向敲除實驗表明這種lncRNA和Hox蛋白一樣對胚胎的正常發育是必不可少的[51]。HOXD基因以及某些印跡位點如DLK1、IGF2（父系印跡）和H19、MEG3（母系印記）的缺失會導致骨骼系統畸形。這些基因的變動會進一步改變機體內基因表達模式，從而導致機體發育異常。

4.2 lncRNA與腫瘤

癌癥的產生是由于細胞在遺傳和表觀遺傳上改變所致。癌細胞上經常發現有染色體的增益或丟失。幾個信號轉導通路像Wnt/β-catenin、MAPK、βp14ARF、p53、TGF-β1、PI3K/Akt等在惡性細胞中發生改變，以產生它們自己的生長因子，達到無限復制，增加血管生成和增殖。此外，它們還逃避生長抑制、逃避凋亡并具有轉移和侵襲的能力[52]。腫瘤細胞轉錄譜研究已闡明了人類基因組中廣大的非編碼轉錄本在腫瘤發生過程中的核心作用。尤其，lncRNA在癌癥的遺傳學和發病機制中表現出關鍵作用，其功能障礙與癌癥的發生、發展和轉移密切相關[53-54]。然而，有些ln?cRNA本身就是致癌的，其表達上調時驅動癌癥發生，另外的lncRNA作為腫瘤的抑制器，只有當它們表達下調時才導致癌癥[55]。

最近一項研究[56]已證明H19基因通過甲基化CpG結合域蛋白1（methyl CpG-binding domain protein1，MBD1）使印跡基因網絡（IGN）中的基因沉默，MBD1能抑制組蛋白H3K9me3。在小鼠體內敲除H19基因不致命，但它的過表達，可能由于H19基因位點印跡缺失[57]或腫瘤抑制基因p53缺失[58]，或致癌基因myc的影響[59]，引發多種惡性腫瘤如肝癌[60-61]、乳腺癌[62]、食管癌[63]、肺癌[64]、胰腺癌[65]、胃癌[66]、膀胱癌[67]和子宮癌[68]，這些癌癥表明該RNA的致癌作用。有研究表明，H19的表達水平與腫瘤分級呈顯著相關，是各種癌癥的一個潛在的生物標志物[69-70]。另外，H19基因外顯子還編碼一個miRNA，即miR-675[64]。miR-675表現出相反的功能，作為一種腫瘤抑制基因抑制IGF1R（胰島素樣生長因子1受體）的表達[71]，因此，這兩者的轉錄水平有助于維持細胞穩態。

2003年發現MALAT1在非小細胞肺癌中高表達，隨后的研究表明MALAT1的表達與腺癌和大細胞癌相關，還可以作為鱗癌患者預后差的一個預后因素[72]。在不同研究中，在肺移植瘤模型和轉移性乳腺癌模型中誘發腫瘤后禁止MALAT1表達能減少腫瘤的轉移。MALAT1基因敲除小鼠并沒有表現出明顯的表型[73]表明在人體下調MALAT1可能對正常人體細胞無害，所以使其系統應用于患者成為有吸引力的目標。除此之外，MALAT1還與子宮頸癌、乳腺癌、膀胱癌、結腸癌等腫瘤相關[74-76]。在癌癥研究中，除了H19和MALAT1，還有許多其他lncRNA得到越來越多的探究。HULC與肝癌相關，HOTAIR與肝癌、乳腺癌、淋巴癌等相關。

lncRNA不僅為我們提供了了解疾病機制的一個新的視角，還提供了新的治療機會[77-79]。事實上，與蛋白編碼基因相比，lncRNA的表達更具組織特異性，因此它們可用于生物標志和治療。lncRNA在體液和組織中是非常穩定的，證明在活組織切片檢查上是有價值的生物標志物，有利于避免對機體有害的生物學進程[80-81]。相關lncRNA的分布和水平可用于評估疾病進展或制定特定的治療方案。

5 結語

作為遺傳學研究的一個新方向，lncRNA近年來受到諸多關注，相關研究不斷深入。lncRNA是具有多種功能的轉錄本，在真核生物的發育過程中起重要作用。大量研究表明，lncRNA可以在轉錄水平、轉錄后水平及表觀遺傳水平調控基因表達，從而影響劑量補償、基因印跡、細胞周期、端粒生物學、亞細胞結構組成、發育、配子形成及染色體結構動態變化等生物學過程。

越來越多的研究表明，lncRNA在干細胞分化過程中發揮重要的調控作用[82-83]。許多lncRNA與胚胎干細胞、神經干細胞及多種細胞的分化有關，對其中的某些lncRNA基因的敲除會引起特有基因表達的變化[84]。蔡世忠等研究證實，多種保守的lncRNA能調控小鼠胚胎干細胞多能性是通過對Oct4和Nanog在轉錄水平的調節實現的[85]。lncRNA是表觀遺傳調控的重要組成部分，在表觀遺傳調控以及細胞周期調控、細胞分化和干細胞的維持等過程中扮演重要角色[86-87]。精原干細胞（somatic stem cell，SSC）是一種具有自我更新、增殖及分化潛能的干細胞。SSC在遺傳信息從體細胞向單倍體雄性配子傳遞的過程中發揮重要作用，其分化過程中分子機理的研究對于動物精子發生機理的探索具有重要意義。然而，目前關于lncRNA對SSC增殖分化影響的報道非常少。探索lncRNA在SSC誘導分化過程中的調控機制，對于闡明精子發生過程中的分子機理具有重要意義，同時可為研究其他干細胞誘導分化的分子機理提供借鑒和理論依據。

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